Summary
Den Virochip är en pan-virus microarray utformat för att samtidigt upptäcka alla kända virus och virus roman på grundval av bevarade sekvenshomologi. Här visar vi hur man driver ett Virochip analys för att analysera kliniska prover för förekomst av både kända och okända virus.
Abstract
Diagnosen av viral orsaker till många infektionssjukdomar är svårt på grund av den inneboende sekvens mångfalden av virus samt den pågående framväxten av nya virala patogener, till exempel sars coronavirus och 2009 pandemiska H1N1 influensavirus, som inte upptäckas med traditionella metoder. För att möta dessa utmaningar har vi utvecklat tidigare och validerat ett pan-virus microarray plattform som kallas den Virochip med kapacitet att upptäcka alla kända virus och nya varianter på grundval av bevarade sekvenshomologi 1. Använda Virochip har vi identifierat hela spektrumet av virus i samband med luftvägsinfektioner, inklusive fall av oförklarlig kritiska sjukdom hos inlagda patienter som har en känslighet motsvarande eller bättre än konventionella kliniska tester 2-5. Den Virochip har också använts för att identifiera nya virus, inklusive sars coronavirus 6,7, en roman rhinovirus klad 5, XMRV (ett retrovirus kopplad till prostatacancer) 8, aviär bornavirus (orsaken till en wasting disease papegojor) 9, och en roman cardiovirus hos barn med lung-och diarrésjukdom 10. Den nuvarande versionen av Virochip finns till en Agilent microarray-plattform och består av ~ 36 tusen sonder härrör från mer än ~ 1500 virus i GenBank och med december 2009. Här kan vi visa de olika stegen i behandlingen en Virochip analys från början till slut (~ 24 timmars handläggningstid), inklusive prov nukleinsyra extraktion, PCR-amplifiering med slumpmässiga grundfärg, fluorescerande färg bolagsordningen och microarray-hybridisering, skanning och analys.
Protocol
Stegen i Virochip analysen omfattar (1) nukleinsyra extraktion från kliniska prover, (2) omvänd transkription av extraherat RNA och 2: a-strand cDNA syntes, (3) PCR-amplifiering av slumpmässigt primas cDNA, (3) Cy3 fluorescerande färg inbyggnad , (4) hybridisering av märkt material till Virochip microarray, och (5) scanning och analys (Figur 1). Protokollet nedan kommer att visa användningen av Virochip analysen på en nasal kompress prov från ett barn med en influensaliknande sjukdom.
Primer Sekvenser
Primer En 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 "
Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 "
1. Nukleinsyra Extraktion
- Nukleinsyra extraktion från kliniska prover bör ske under biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) eller högre villkor, eftersom dessa prover är potentiellt smittsamma.
- Nasal provstickan provet transporteras i viral hålla medium. Alikvotera 200 mikroliter av provet i ett 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifugrör.
- Tillval: passera provet genom ett 0,22 ìm filter (för att rena för viruspartiklar)
- Tillval: förbehandla provet med DNAse (att bryta ned DNA värd genomiska och rena för skyddade, encapsidated virusets nukleinsyra) med hjälp av Turbo DNAse kit (Ambion) per tillverkarens anvisningar
- Extrahera provet med hjälp av Zymo ZR RNA Extraction Kit eller Qiagen Ultrasens Virus Kit per tillverkarens anvisningar.
2. Omvänd transkription och 2: a-strängen cDNA syntes ("v")
- Tillsätt 1 uL 40 pmol / mikroliter Primer A till 4 uL extraherat RNA. Värm till 65 ° C i 5 min i en termocykler (t.ex. GeneAmp PCR System 9700) och låt svalna i rumstemperatur x 5 min.
- Tillsätt 5 mikroliter av en mästare blandning bestående av 2 mikroliter 5X RT-buffert, 1 mikroliter 12,5 mM dNTP, 1 mikroliter vatten, 0,5 mikroliter 0,1 miljoner DTT och 0,5 mikroliter SSIII RT (Invitrogen). Inkubera vid 42 ° C x 60 minuter.
- I en programmerbar termocykler, värm till 94 ° C x 2 min (för att avbryta omvänt transkriptas reaktion), kyl till 10 ° C, puls centrifugering, och tillsätt därefter 5 mikroliter Sequenase blandning bestående av 1 mikroliter 5X Sequenase buffert, 3,8 mikroliter vatten, och 0,15 mikroliter Sequenase (USB Corporation). För 2: a del syntes, ramp upp från 10 ° C till 37 ° C över 8 minuter, håll 8 min, värm sedan till 94 ° C x 2 min (för att inaktivera Sequenase) och kyl till 10 ° C (håll).
- Tillval: Rd Ett prov cDNA kan lagras på denna punkt vid -20 ° C.
3. PCR-amplifiering av Grundmålade slumpmässigt cDNA ("Round B")
- Tillsätt 5 ul av RD Ett prov till 45 mikroliter av Master Mix består av 5 mikroliter 10X PCR-buffert, 1 mikroliter 12,5 mM dNTP, 1 mikroliter 100 pmol / mikroliter primer B, 1 mikroliter KlenTaq LA (Sigma), och 37 mikroliter vatten.
- Kör PCR-protokoll som följer: 94 ° C, 2 min → (25 cykler av 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( håll)
- Kontrollera Rd B-provet på en 1,5% agaros elektrofores gel. En smear från cirka 200 - 1000 BP ska visualiseras (Figur 2A)
4. Cy3 fluorescerande färg Bolagsbildning
- Tillval: andra prov kan märkas med Cy5 fluorescerande färg och hybridiseras till samma microarray.
- Att införliva aa-dNTP, tillsätt 5 ul Rd B prov till 45 ul av en mästare mix bestående av 5 ul 10X PCR-buffert, en uL 12,5 mm AA-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / UL primer B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), och 37 uL vatten. Kör PCR-protokoll som följer: 94 ° C, 2 min → (15 cykler av 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( håll)
- Rengör Rd C provet med DNA Clean och Concentrator-5 Kit (Zymo Forskning) enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 10 mikroliter.
- Tillsätt 1 ul 1M bikarbonat (Sigma) och 1 uL Cy5 (GE Healthcare) till RD C provet.
- Inkubera x 1 timme i mörker.
- Rengör Cy3-märkta prov med DNA Clean och Concentrator-5 Kit (Zymo Forskning) enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 12 mikroliter.
5. Hybridisering till Virochip microarray
- Tillval: Använd 1,5 mikroliter att kolla cDNA koncentrationen och mängden färg som ingår i en Nanodrop spektrofotometer (för normalisering av prover)
- I ett PCR-remsa rör tillsätt 1 mikroliter 25X fragmentering buffert, 5 mikroliter 5X blockerande buffert, 9,5 mikroliter (eller belopp att normalisera) av Cy3 märkt prov, och vatten till en total volym av 25 mikroliter (Agilent)
- Tillsätt 25 mikroliter av 2X Gex hybridisering buffert (Agilent). Spinn ner kort för att ta bort bubblor.
- Belastning 40 mikroliter av provet på packningen bild.
- Placera Agilent tryckta Virochip array (University of Californien, San Francisco / Agilent) (sidan märkt "Agilent" nedåt) ovanpå packningen bilden och fäst skruven hårt.
- Hybridisera över natten i 65 ° C ugn, hastighet inställning vid 10 rpm.
- För att tvätta arrayer, förvärma buffert 2 (Agilent) till 37 ° C. Ta isär packning bild / array smörgås under vattnet i buffert 1 (Agilent). Tvätta i buffert 1 x 1 min. Tvätta i förvärmd buffert 2 x 1 min. Ta långsamt glida ur buffert 2, som är noga med att undvika bubblor (använd kimwipe att transportera bort extra fukt Var noga med att undvika en direkt beröring aktiva sidan av Array)
- Placera glida in diapositivhållaren och sätt in array scanner.
6. Virochip Scanning och analys
- Scan Cy3-märkta samling på 5 ìm eller 2 ìm enligt instrumentets standard scanning protokoll (Figur 2B).
- Analysera Virochip microarrays genom okulär besiktning, klusteranalys, eller den automatiserade Virochip analysprogram, E-Förutspå 11. Genom alla dessa tre metoder är influensavirus lätt påvisas i näsans pinnen prov (från ett barn med influensaliknande sjukdom) (Figur 2C)
7. Representativa resultat:
När protokollet är gjort rätt ska ett utstryk ses på agarosgelelektrofores efter Rd B steg (Figur 2A). Den Virochip microarray på Agilent plattformen kommer att vara svårt att analysera visuellt (Figur 2B), men om ett virus finns det ska vara lätt identifieras genom visuell inspektion, klusteranalys, och / eller E-förutsäga (Figur 1C). Prover kan spetsas med uppmätta mängder av nukleinsyra från ett känt virus (t ex tobak viruset, MS2 bakteriofag) att fungera som en positiv kontroll för analysen.
Figur 1. Schematisk bild av Virochip microarray bearbetning och analys. Utvinns nukleinsyra från kliniska prover slumpmässigt förstärks, märkta med fluorescerande färger och hybridiseras till Virochip microarray. Microarrays skannas på 2 ìm upplösning och analyseras med hjälp av olika beräkningsmodeller verktyg, inklusive E-förutse.
Figur 2. Stegen i Virochip analysen Efter förstärkningen av slumpmässig PCR, ett utstryk av 200 -. 1000 BP kan visualiseras med gelelektrofores (A) (B) Tre Virochip mikroarrayer av de 8 arrayer / glasskiva visas, med en liten region. av en microarray blåst upp i infällda i nedre högra hörnet. (c) Automatisk microarray virus analys med hjälp av E-Förutsäga avslöja förekomsten av influensa A-virus i den kliniska prov. Den höga likheten poäng (s = 0,55) motsvarar ett p-värde som är nära noll, vilket gör detta till ett mycket viktigt förutsägelse.
Discussion
Den Virochip protokoll som beskrivs här är komplex och kräver en noggrann och skicklig forskning tekniker. Korrekt reagens koncentrationer och villkor för PCR, märkning och hybridisering är kritiska. Den Virochip protokoll kan enkelt modifieras för att rymma en analys av sjuk vävnad med hjälp av en vävnad extraktion metod såsom TRIzol (Invitrogen) för nukleinsyra extraktion. Givare kan läggas till eller tas bort efter behov för att uppnå önskad spektrum och bredd täckning, till exempel, kan prober för detektion av nonviral mål såsom bakterier och svampar skall utformas och läggas "on-the-fly". Några tillämpningar av Virochip analysen för närvarande under utveckling inbegriper ett brett spektrum virusdiagnostik i den kliniska laboratorium, utbrott utredning, renhet screening av läkemedel och vacciner, och nya virala patogener upptäckt.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar David Wang, Anatolij Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, och Alexander Greninger för den inledande utvecklingen och optimering av Virochip protokollet. Detta arbete stöds av en NIH K08 bidrag och Abbott Discovery Award (till CC) och Howard Hughes Medical Institute (till JLD).
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
