Summary
在这里，我们描述了一种方法，有效地扩大和净化人类NK细胞的大量和评估它们的功能。
Abstract
自然杀伤（NK）细胞，发挥对各种传染病的微生物和肿瘤免疫监视的重要作用。 NK细胞在体外的能力，扩大有限已成为制约NK细胞免疫治疗的发展。在这里，我们描述了一个方法，有效地扩大功能NK细胞体外大量使用K562细胞表达膜结合IL21，作为人工抗原提呈细胞（AAPC ）。
NK细胞收养疗法利用细胞耗尽的T细胞或NK细胞的阳性选择捐助的稳态leukapheresis获得的产品。该产品通常是在IL - 2激活过夜，然后管理翌日1。由于低频外周血NK细胞，NK细胞的数量相对较少，已交付的临床试验。
不能传播NK细胞在体外已为最佳的临床结果产生足够的细胞数量的限制因素。一些NK细胞的扩张（超过1-2周的5-10倍）通过高剂量IL - 2仅2。激活自体T细胞可以介导NK细胞扩张，想必也通过局部细胞因子3的释放。与间质的基质或人工抗原提呈细胞（AAPCS）的支持，可以支持扩展的NK细胞从外周血和脐带血 4 。结合NKp46和CD2抗体包被的磁珠激活NK细胞扩张（美天旎生物技术公司，奥本CA）是目前市场上销售，造成约100倍，在21天的扩张。
使用AAPC扩大或激活NK细胞的临床试验正在进行中，一个白血病细胞株CTV - 1素和激活NK细胞无显着扩大。一，二审利用NK细胞扩展的EB病毒拼箱，实现了平均490倍，扩大在21天6。第三，利用基于一个K562 AAPC转4 - 1BBL（CD137L）和膜结合IL - 15（MIL - 15）7，取得了在21天的平均NK扩张277倍。虽然，NK细胞扩大使用K562 - 41BBL - mIL15 AAPC高度细胞毒性， 在体外和体内未展开的NK细胞相比，参与的ADCC，其增殖是有限的，归结到端粒的缩短8由衰老。最近的NK细胞的350倍扩大使用K562细胞表达MICA，4 - 1BBL和IL15 9的报道。
我们的NK细胞扩展的方法描述，此处产生的NK细胞不衰老的迅速扩散，实现在21天的中位数为21,000倍扩张。
Protocol
1。从Buffy大衣的外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞（PBMC）的聚蔗糖 - 帕确来自健康捐赠者巴菲外套leukapheresis派生样本的浮力密度离心获得。
- 聚蔗糖帕确离心作为生产商的协议稍作修改。
- PBS将正常的捐助者的血液银行捉鬼外套到终体积为140毫升（典型的棕黄色大衣量为40-70毫升）。
- 层35毫升15毫升（4管）聚蔗糖 - 帕确捉鬼外套样品。
- 在400克离心20分钟不带刹车。
- 恢复从聚蔗糖 - 帕确外周血：等离子接口，不放弃的聚蔗糖 - 帕确底部的红细胞。
- 洗净外周血单个核细胞用PBS洗3次，每次10分钟，离心于400克。
- 在这个阶段的NK细胞膨胀或NK细胞，外周血单个核细胞可以直接使用可以通过RosetteSep隔离（第4）
- 剩余的外周血单核细胞可以被冻结在FBS的液态氮中含10％DMSO。
- 吸聚蔗糖和收集到两个50 mL离心管中，从第5步中的红细胞，用PBS（添加50毫升大关）洗三次，每次吸出上清液略读红细胞层的顶部删除粒。
- RosetteSepNK细胞的纯化（参见第4节）的红细胞，可立即使用，或存储在同等体积的Alsever的解决方案，在4 ° C，为以后使用的红细胞（可存储最多为4周）。
2。 NK细胞扩张
使用外周血或纯化的NK细胞，NK细胞可以启动扩大。在结束了一个为期三周的扩张所需的NK细胞数量的基础上，量的扩张外周血可以是多种多样的，代表结果的详细信息部分。 （见注1）
刺激1
0天
- 对于每个5X10 6外周血扩大，数量和使用在100 Gy的伽玛辐照， 照射 10X10 6 K562 CL9 mIL21。
- 照射后，用PBS重悬在NK细胞扩张媒体（NKEM）洗细胞。
- 种子5X10 6外周血10X10 6照射K562 CL9 mIL21（1:2比例）在40毫升的NKEM在T75烧瓶中，并放置在一个孵化器直立在37 ° C和5％的CO 2 。
3和第5天
- 恢复细胞在400克离心5分钟，并更换新鲜NKEM媒体的一半（整个媒体音量加入新鲜的IL - 2），并继续文化。
刺激2
第7天
- 计数细胞的数量，在文化，在一个星期结束。
- 抛开5X10 5分型流式细胞仪检测细胞（见注2）
- 对于每个5X10 6 restimulated细胞，数量和使用伽玛辐照在100 Gy的照射5X10 6 K562 CL9 mIL21 。
- 在总额2.5 × 10 5细胞/ mL添加照射K562 CL9 mIL21（1:1比例），重悬在NKEM人数相等（见注3）。
- 种子细胞在T75烧瓶（最高，每50毫升容量瓶中）。
10和12天
- 计数的细胞数量。
- 更改与基于手机号码的新鲜NKEM的整个媒体（见注3）。
第14天
- 在两个星期的扩张结束计数文化中的细胞数量。
- 抛开5X10 5分型流式细胞仪检测细胞（见注2）
- 如果扩张开始从外周血NK细胞可以在这个阶段使用扩展RosetteSep净化协议（参考第四节）纯化。如果扩张开始从纯化的NK细胞进行刺激3。
- 净化后预留5 × 10 5细胞表型流式细胞仪验证的NK细胞（如在第8步）的纯度。
- 继续刺激使用纯化的NK细胞（见注4）3。
刺激3
- NK细胞悬浮照射K562 CL9 mIL21 NKEM根据手机号码（1:1比例）（见注3）。
17和19天
- 计数的细胞数量。
- 更改与基于手机号码的新鲜NKEM的媒体（见注3）。
第21天
- 在三个星期的扩张结束计数文化中的细胞数量。
- 恢复1 × 10 6流式细胞仪分析细胞完整的NK细胞表型抗体面板（见表1） 。
- 冻结在FBS的细胞用含10％DMSO在5X10 7％，以供将来使用的小瓶细胞的最大密度。
3。 NK细胞毒性试验
- 在NKEM解冻小瓶NK细胞和种子，前一天到PErforming细胞毒试验，以便恢复。
- 对于每个NK细胞的细胞毒作用，使用单一的目标细胞株，6x10 5 NK细胞和 3X10 5靶细胞检测的要求（见注5）。
- 准备稀释钙黄绿素- AM NKEM（股票1 mg / ml的DMSO）（见注6）的CAM媒体。
- 重悬在1毫升CAM媒体10 6靶细胞（见注7）。
- 在37 ° C孵育1小时，偶尔晃动。
- 悬浮NK细胞在1 × 10 6细胞/ ml的细胞和NK细胞悬液200uL，每个U型底部的3口井的96孔板对应到10：1 E：T比例如图1所示。 （见注8）
- 新增完整的媒体100uL除了“最大”的所有其余井。
- 加入100uL 2％TRITON X - 100“最大”。
- 执行串行稀释度为5后续电子邮件的NK细胞，T细胞转移100uL每次比例，拌匀。丢弃从上井（E：T比值为0.3125:1）100uL。
- 钙黄绿素装载1小时后，在NKEM洗两次靶细胞，5分钟1200转离心。 （见注9）
- 重新点票的靶细胞和悬浮在1 × 10 5细胞/ mL。
- 每孔加入100μL靶细胞（1 × 10 4 /以及）。离心机在百克1分钟，以启动细胞接触。
- 在37 ° C和5％CO 2 4小时。
- 轻轻移液100μLpipetter以均匀暂停释放的钙黄绿素混合的文化，在百克降速盘5分钟沉淀细胞和照顾，以避免气泡100μL上清转移到一个新的板块。任何弹出的气泡，可能会形成使用细针。
- 用荧光酶标仪（485 nm处激发滤光片，发射滤波器530 nm）读取的板块。底部阅读建议。
- 根据具体裂解百分比计算公式[（测试版自发释放）/（最大释放 - 自发释放）] × 100。
4。由RosetteSep NK细胞净化
- 取外周血或扩大细胞，放入50 mL的管（100:1红细胞：PBMC）的100倍，多余的红细胞。
- 如果使用的新鲜红细胞直接进行下一步，如果在Alsever的解决方案中的红细胞计数，红细胞数量和洗适当（100倍超额）补充含2％FBS三次用PBS红细胞的数量，在1200转离心每次10分钟。
- 结合步骤1.7或在PBS 2.10步扩 大细胞的外周血红细胞+ 2％胎牛血清的1毫升每5X10 7外周血或扩大细胞的最终体积。
- 添加RosetteSep1μL人类NK细胞富集外周血或扩大细胞每1 × 10 6鸡尾酒。
- 搅拌均匀，在室温下孵育20分钟，轻轻搅拌，每隔5分钟。
- 加入等体积PBS + 2％FBS混合轻轻上一层聚蔗糖 - 帕确顶部。
- PBMC中隔离所述的聚蔗糖帕确离心重复步骤（第一节）。
- 计数净化后回收的NK细胞和预留5x105细胞通过流式细胞仪检测NK细胞纯度（步骤8）phenotpying。
5。注释
注意：1。NK细胞可扩大直接从外周血单个核细胞，或从RosetteSep纯化NK细胞。我们已经注意到了类似的扩张效率，但一些捐助者可能具有非常低的NK细胞数量，造成困难净化RosetteSep前扩张。
注2：我们经常使用的表型CD56 - FITC，CD16 - PE，CD3 - PE - Cy5的扩张期间，列举那些CD3阴性，CD16或CD56阳性的NK细胞。
注3：在每个媒体的变化或刺激，悬浮细胞在2.5 × 10 5 /毫升，以保持在或低于2万每毫升外周血单核细胞/ NK细胞数量扩张的高峰阶段。这将防止营养物质的耗竭，并帮助实现最大的扩张和生存。
注4。NK的扩张速度是捐助者的依赖，在刺激1或2的细胞可以被冻结的部分月底和部分进一步扩大，根据实验的需要。我们有很好的成功，在使用冷冻细胞在稍后的时间扩展。
注5：为了让错误的空间，我们建议使用最低 7x10 5 NK细胞重悬在700 ULS NKEM和4 × 5钙黄绿素- AM染色目标4 NKEM毫升悬浮细胞设立的细胞毒试验。如果使用播种靶细胞的细胞量较高（6毫升6x10 5），可能需要的基础上正在使用的大小媒体盆地多道移液器。也是推荐的NK细胞数量是专为E：T比例显示在协议中，使用更高的发送：T比率增加NK细胞每毫升相应的号码（例如：40:1发送：T比值使用4 × 6细胞/ ml）
注6：我们建议进行了初步的首选目标细胞株的滴定钙黄绿素- AM加载，使用以下1:500，1:400稀释。 1:300，1:200和1:100，实现最大的和自发的释放之间的最佳差异。
注7：当使用贴壁细胞系作为目标，先准备单细胞悬液，使用非酶细胞分解缓冲区。如果执行的ADCC，准备在CAM媒体重复管的靶细胞。
注8，如果执行的ADCC，添加相同的NK细胞，以3口井，对应10:1 E： 为 ADCC的T。重复更多的捐助者。重复额外的靶细胞。
注9：如果执行的ADCC实验，钙黄绿素装载45分钟后，添加诱导对靶细胞的ADCC的特定抗体10ug。 15多分钟后，靶细胞完全培养基清洗两次，5分钟1200转离心。悬浮细胞在1 × 10 5细胞/ mL，并在协议的下一步骤进行。
6。代表性的成果
图2当膨胀是按照计划进行上文所述，典型的NK细胞产生范围从1x10 9 10 10个细胞（捐助者的依赖变异）为起始原料，采用5x106外周血单个核细胞。图中显示NK细胞倍的扩张（N = 19）相比，在原有的产品中存在的NK细胞（中位数+ / - 四分位数）。
图3：扩大NK细胞表达不同的NK细胞受体与少数例外（CD11b表达，CD160和CD244）未展开的主要NK细胞相媲美的。
图4。外周血从Buffy大衣的恢复是捐助者的依赖，范围可以从300x10 6 800x10 6 。 NK细胞可占2％ - 18％的外周血单个核细胞。 RosetteSep扩大细胞的纯化，回收纯NK细胞从40-70％14天范围。通过以下建议扩大和净化的协议，NK细胞纯度达99％，可以预期的。
图5。扩大NK细胞都表现出对肿瘤细胞株的范围，包括神经母细胞瘤，白血病，骨肉瘤和黑色素瘤（代表反洗钱杀害％的具体裂解所示）的细胞毒性。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢他们的工作，在创建初始K562 AAPC和mIL21融合向量劳伦斯库珀，Harjeet辛格和LENKA Hurton。
为这项工作提供了资金的UT MD安德森医师科学家计划，圣Baldrick的基金会，Friendswood的传奇。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM) |
|||
| 90% RPMI 1640 | Cellgro | ||
| 10% Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| 1x Penicillin / Streptomycin | Cellgro | ||
| 1x L-Glutamine | Gibco | Filter Sterilize media before use. | |
| 50 U/ mL IL2 | Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc) | Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
PBMC and NK Cell Isolation |
|||
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | ||
| Alsever's solution | Sigma) | ||
| RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail | Stemcell Technologies) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
NK Cell Cytotoxicity Assay |
|||
| Calcein-AM | Invitrogen | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies |
|||
The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below: |
|||
Tube 1: (total volume 100) |
|||
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 555748 | Volume: 5 |
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 555749 | Volume: 5 |
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 557224 | Volume: 5 |
| Antibody: Isotype FITC | BD Pharmingen | 340442 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
Tube 2: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: NKp30 PE | BD Pharmingen | 558407 | Volume: 5 |
| Antibody: NKp44 PE | BD Pharmingen | 558563 | Volume: 5 |
| Antibody: NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD16 Alexa 647 | BD Pharmingen | 557710 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 70 | |
Tube 3: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: KIR2DL1 PE | R&D Systems | FAB1844P | Volume: 5 |
| Antibody: KIR2DL2/3 PE | Miltenyi Biotec | 130-092-618 | Volume: 5 |
| Antibody: KIR3DL1 PE | R&D Systems | FAB12251P | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: NKG2D APC | BD Pharmingen | 558071 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 70 | |
Tube 4: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: CD11b PE | BD Pharmingen | 555388 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD27 APC | BD Pharmingen | 558664 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
Tube 5: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: CD266 (DNAM-1) PE | BD Pharmingen | 559789 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD160 Alexa647 | eBiosciences | 51-1609-42 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
Tube 6: (total volume 100) |
|||
| Antibody: CD56 FITC | BD Pharmingen | 340410 | Volume: 5 |
| Antibody: CD244 (2B4) PE | BD Pharmingen | 550816 | Volume: 5 |
| Antibody: CD3 PE-Cy5 | BD Pharmingen | 555341 | Volume: 5 |
| Antibody: CD197 (CCR7) APC | eBiosciences | 17-1979-42 | Volume: 5 |
| Antibody: FACS Buffer | BD Pharmingen | Volume: 80 | |
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