Summary
In questo rapporto si descrive un metodo per l'isolamento e la coltura della nicchia delle cellule progenitrici dal rene embrionali di topo che può essere utilizzato per studiare vie di segnalazione che regolano staminali / progenitrici delle cellule del rene di sviluppo. Queste cellule in coltura sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che consente la manipolazione efficiente di percorsi candidato.
Abstract
Sviluppo embrionale del rene è stato ampiamente studiato sia come modello per l'interazione epitelio-mesenchimale in organogenesi e per guadagnare la comprensione delle origini della malattia renale congenita. Più recentemente, la possibilità di sterzo ingenuo cellule staminali embrionali verso destini nefrogenico è stato esplorato nel campo emergente della medicina rigenerativa. Studi genetici nel topo hanno identificato diversi percorsi necessari per lo sviluppo del rene, e un catalogo globale di trascrizione del gene nell'organo è stata recentemente generato http://www.gudmap.org/ , fornendo regolatori candidato numerose funzioni essenziali dello sviluppo. Organogenesi del rene roditori possono essere studiati in coltura d'organo, e le relazioni molti hanno utilizzato questo metodo per analizzare i risultati delle due proteine applicare candidato o abbattere l'espressione di geni candidati utilizzando siRNA o Morpholinos. Tuttavia, l'applicabilità della cultura d'organo allo studio di segnalazione che regola staminali / differenziazione delle cellule progenitrici verso il rinnovo nel rene di sviluppo è limitato come organi colto contenere una diffusione compatto matrice extracellulare limitazione delle macromolecole e particelle virali. Per studiare la cellula di segnalazione eventi che influenzano le staminali / progenitrici di cellule di nicchia nel rene abbiamo sviluppato un sistema primario cella che stabilisce la zona nefrogenico o cellule progenitrici di nicchia del rene sviluppo ex vivo in isolamento dal induttore di differenziazione epiteliale. Utilizzando limitato digestione enzimatica, le cellule della zona nefrogenica può essere selettivamente liberato dallo sviluppo di reni a E17.5. A seguito di filtrazione, queste cellule possono essere coltivate come un monostrato irregolari con condizioni ottimizzate. Gene marcatore analisi dimostra che queste culture contengono una distribuzione dei tipi di cellule caratteristico della zona nefrogenico in vivo, e che dispongono di idonee espressione del gene marcatore durante il periodo di coltura. Queste cellule sono altamente accessibile a piccole molecole e proteine ricombinanti trattamento, e, cosa importante anche per trasduzione virale, che facilita enormemente lo studio degli effetti delle cellule staminali candidato / progenitrici regolatore. Parametri cellula base biologici quali proliferazione e morte cellulare così come i cambiamenti nell'espressione di marcatori molecolari caratteristici della nefrone cellule staminali / progenitrici in vivo può essere usato con successo come risultati sperimentali. I lavori in corso nel nostro laboratorio utilizzando questa nuova tecnica cellula primaria mira a scoprire i meccanismi di base che regolano la regolamentazione di auto-rinnovamento contro nefrone differenziazione in cellule staminali / progenitrici.
Protocol
1. Reagenti per la preparazione digestione del rene
- 1,5 ml di 0,25% Collagenasi A (w / v) e soluzione 1% Pancreatina digerire (w / v) saranno necessari per l'estrazione di cellule zona nefrogenica (NZCs) da 8 E17.5 reni. Perché Pancreatina dura circa 2 ore per sciogliere a temperatura ambiente, basta digerire soluzione per il maggior numero di rene embrionale attesi dovrebbero essere fatte prima dell'esperimento. Preparare digerire soluzione in primo luogo l'aggiunta di 25 mg di Collagenasi A fosfato 10 ml Soluzione salina tamponata Dulbecco (DPBS) in modo chiaro da 15 ml, provetta sterile. E 'fondamentale che il DPBS non contiene calcio e magnesio in quanto interferiscono con la digestione enzimatica. Mescolare soluzione su un nutator per 10 minuti per sciogliere Collagenasi A. Aggiungere 100 mg di pancreatina a Collagenasi sciolto Una soluzione e mescolare su un nutator per almeno 2 ore. In alternativa, Collagenasi A / Pancreatina soluzione di analisi possono essere mescolati in un nutator notte a 4 ° C. Si consiglia di indossare una maschera, come Collagenasi A e Pancreatina disperdono facilmente in atmosfera durante la pesatura e può causare irritazione delle vie nasali.
- Preparare un 5% di siero fetale bovino (FBS) (v / v) in soluzione salina tamponata di Hank (HBSS). Miscelare. 1 ml per ogni tubo di 8 reni sarà necessario.
- Preparare un terreno di coltura, completandola cheratinociti medio siero libero con 1% glutamina (v / v) e 1% penicillina-streptomicina (PenStrep) (v / v).
- Cappotto sterile fondo piatto in polistirolo tessuto piastre di coltura (96, 48, 24 o 6 così) con la soluzione fibronectina umana ad una concentrazione di 5 mg per cm 2 di superficie di crescita. 5 mg di polvere di fibronectina è risospeso in 5 ml di soluzione sterile H 2 O. Questo è diluito 1:25 in DPBS sterile senza calcio o di magnesio e 250 ml sono aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra ben 24. Le piastre sono poi incubate con una soluzione fibronectina a temperatura ambiente per 1 ora seguita da 1 ora a 4 ° C. In alternativa, le piastre possono essere incubate overnight a 4 ° C. La soluzione viene poi aspirato in una cappa a flusso laminare prima dell'aggiunta di medio / cellule.
2. Reni dissezione e rimozione di capsule (Fatto a temperatura ambiente)
- A E17.5, il sacrificio della madre con una procedura approvata dal vostro Cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, rimuovere l'utero, e metterlo in una capsula di Petri contenente DPBS con calcio e magnesio. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare orologiai 'forcipe per rimuovere ogni embrione dall'utero e decapitare ogni embrione. Una volta che l'intera cucciolata è fuori dell'utero, trasferire gli embrioni per un piatto pulito Petri contenenti DPBS basta con il calcio e magnesio per coprire interamente gli embrioni lasciando dietro di sé come molto sangue e frammenti di tessuto possibile.
- Utilizzando pinze, fare una incisione circonferenziale della parete addominale dell'embrione a livello dell'ombelico. Poi posto l'embrione sul dorso, perno verso il basso alle spalle con un set di pinze, e rimuovere gli organi interni dai polmoni fino alla vescica con l'altro set di pinze. Con la pratica questo può essere fatto in un unico movimento. I reni devono essere allegati alla parte posteriore della massa di organi. Se i reni non rimangono attaccati agli organi eviscerati, possono essere accuratamente rimosso dalla parete dorsale del corpo. Reni che sono stati danneggiati nel corso di questo processo di dissezione deve essere eliminata in quanto saranno contaminare la cultura finale con tipi di cellule inappropriate.
- Delicatamente stuzzicare via i reni dal resto degli organi, avendo cura di mantenere i reni collegati tra loro. Tenere il tessuto tra i reni con un set di pinze e prendete la ghiandola surrenale collegato a uno dei reni con le pinze altri. La ghiandola surrenale deve essere collegato alla capsula renale. Buccia delicatamente la ghiandola surrenale e dalla capsula intorno alla parte esterna del rene, simile a sbucciare una banana. Fare attenzione a non dividere il rene a metà mentre peeling, ed essere sicuri di non danneggiare il tessuto renale al di sotto della capsula. Rimuovere con cura ogni capsula rimanente, come pure l'uretere se è ancora attaccato. Ripetere con il rene residuo.
- Utilizzare una pipetta trasferire taglio di inserire i reni in una provetta di polistirolo 5 ml di HBSS. Ripetere i passaggi 2,2-2,4 per ogni embrione. Reni possono essere raggruppati 8 per tubo. Con rimozione pratica, la dissezione e la capsula si terrà 2-3 minuti per ogni embrione.
3. La digestione enzimatica di Reni (tutti i passaggi a temperatura ambiente salvo diversa indicazione)
- Rimuovere la soluzione HBSS da provette da 5 ml contenente reni con una pipetta, mentre con cura evitando il contatto con i reni. Immediatamente aggiungere 1,5 ml di Collagenasi A Pancreatina / soluzione di analisi per il tubo 5 ml contenente reni prima di passare al campione successivo. Ripetere per ogni tubo di reni.
- Tubi posto con l'enzima / reni digerisce su un nutator in un pre-riscaldato a 37 ° C incubatore per 15 minuti. 2 minuti primacompletamento del digest, aggiungere 3 ml di DNasi (1 U / ml) a un dolce in polistirene 5 ml per ogni digerire in corso.
- Rimuovere rapidamente digerisce da incubatore, aggiungere 75 ml di FBS e capovolgere 3 volte per mescolare. Lasciate riposare in panchina per 2 minuti.
- Trasferire 1,4 ml di sospensione cellulare al tubo di polistirene da 5 ml contenente DNasi (1 U / ml), lasciando il restante 0,2 ml di sospensione cellulare e reni dietro. L'extra 0,2 mL di soluzione lasciato conterrà impurità come matrice extracellulare.
- Mix sospensione cellulare / DNase su un nutator in un pre-riscaldato a 37 ° C incubatore per 10 minuti.
- Rimuovere rapidamente sospensioni cellulari da incubatore e trasferire ciascuna in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. Spin sospensioni cellulari in microcentrifuga a 325 g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante dal pellet e risospendere pellet in 1 ml di 5% di FBS / HBSS, pipettando su e giù 5 o 6 volte. Cap ciascun tubo prima di passare al campione successivo.
- Spin sospensioni cellulari in una microcentrifuga a 325 g per 5 minuti.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,5 ml di cheratinociti media i livelli di free (KSFM) con additivi per ogni tubo e tubo tappo prima di passare al campione successivo. Dopo medio è stato aggiunto a tutti i tubi, risospendere delicatamente ogni cella pellet pipettando su e giù 5 o 6 volte con una micropipetta 1ml. Combina tutte le sospensioni di cella in una fresca 5 ml di tubo in polistirolo.
- Pre-umido due da 40 micron cellule tappi filtro collocato su una provetta da 5 ml in polistirolo fondo rotondo con KSFM per campione. Passano sospensioni cellulari attraverso un tappo cellula filtro trasferendo con una micropipetta 1 ml. Evitare di toccare il filtro con la punta della pipetta. Raccogliere flow-through e ripetere filtrazione attraverso il tappo filtro secondo. Togliere il tappo filtro cellulare e sostituirlo con un nuovo tappo di un tubo normale 5 ml in polistirolo.
- Contare le celle con un emocitometro o il conteggio delle cellule di altri dispositivi e le cellule trasferimento in pozzetti di una piastra fibronectina cultura patinata ad una densità di 100.000-200.000 cellule per cm 2, diluendo se necessario con KSFM con additivi. In generale, si recupera circa 4.5x10 6 celle per 10 cucciolata embrione.
- Incubare le cellule a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO 2.
- Consentono alle cellule di recuperare e fissare per 2-4 ore in media prima della stimolazione con reagenti aggiuntivi. Stimolano le cellule con il composto di interesse da 1 a 48 ore. Purificare l'RNA per analisi PCR utilizzando il Qiagen RNeasy Micro Kit seguendo le istruzioni del produttore o seguire le istruzioni qui sotto per immunostain fluorescenti le cellule.
4. Reagenti per la preparazione di fissazione delle cellule e immunocolorazione
- Preparare 4% PFA: sciogliere 4% paraformaldeide in PBS (v / v) a 55 ° C con agitazione regolari. Raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso. Questa soluzione è tossico e deve essere eliminata in contenitori per residui designato.
- Preparare la soluzione di permeabilizzazione con l'aggiunta di Triton X-100 di PBS per ottenere una soluzione allo 0,3% (v / v).
- Preparare una soluzione al 5% di blocco in PBS con siero della stessa specie, come è stato utilizzato per sollevare l'anticorpo secondario da utilizzare. Per esempio, se si rileverà un anticorpo di coniglio contro il vostro antigene bersaglio con un asino anti-coniglio Alexa Fluor 568, preparare una soluzione bloccante contenente siero asino 5%. Conservare a 4 ° C.
- Preparare la soluzione primaria di anticorpi aggiungendo la giusta concentrazione di anticorpi al 5% di soluzione di blocco.
- Preparare la soluzione secondaria di anticorpi immediatamente prima dell'uso. Aggiungi fluoroforo anticorpo coniugato a una concentrazione consigliata dal costruttore, insieme con il nucleare di contrasto DAPI e altri marcatori di organelli come falloidina di soluzione al 5% di blocco. Se lo stoccaggio è necessario, conservare la soluzione al buio a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare il 50% glicerolo / PBS soluzione (v / v) per la conservazione di cellule immunostained. In alternativa, Vectashield può essere utilizzato.
5. Fissazione delle cellule e immunocolorazione
- Il protocollo seguito è progettato per la fissazione e la colorazione di NZCs in un piatto ben 24. I volumi indicati sono per un singolo pozzo. Reagenti devono essere delicatamente pipettati durante tutte le fasi per evitare il distacco delle cellule, e piastra di agitazione non è raccomandato nelle fasi di incubazione.
- Rimuovere delicatamente con una media da 1 ml micropipetta e aggiungere 0,5 ml di PFA 4% per attaccati cellule in coltura. Incubare per 15 minuti indisturbati a temperatura ambiente.
- Rimuovere il 4% PFA e aggiungere 0,5 ml per pozzetto di soluzione permeabilizzazione. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e risciacquare delicatamente due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare.
- Aggiungere 0,5 ml di soluzione di blocco e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti.
- Rimuovere soluzione di saturazione e aggiungere 0,225 ml di soluzione di anticorpo primario.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o una notte a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e delicatamente riNSE due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare.
- Aggiungere 0,225 ml di soluzione di anticorpo secondario. Incubare piastra al buio a temperatura ambiente per 60 minuti.
- Rimuovere la soluzione secondaria di anticorpi e delicatamente lavare due volte con 0,5 ml di PBS per risciacquare.
- Aggiungere 0,3 ml di 50% glicerolo / PBS soluzione (v / v) o Vectashield sufficiente per coprire parte inferiore della superficie bene.
- Celle di immagine con microscopio a epifluorescenza o conservare avvolto in un foglio a 4 ° C.
6. Rappresentante Risultati
Figura 1. NZCs sono stati purificati da E17.5 embrioni, placcato a 200.000 cellule per cm 2 e incubate a 37 ° C per un totale di 24 ore. Le cellule sono state ripreso dal contrasto di fase con un microscopio Leica DM IRB invertita prima della colorazione immunofluorescenza. (A) 20X contrasto vista fase di NZCs dopo 24 ore di cultura. (B) Le cellule sono state fissate e colorate con un anticorpo anti-PAX2 coniglio specifici per le cellule progenitrici nefrone (rosso) e uno secondario Alexa Fluor 568 coniugato asino anti-coniglio. Nota nuclei blu di contrasto con DAPI. (C) 40X contrasto fase di vista di un gruppo di progenitori nefrone (centrato) dopo 24 ore di cultura. (D) l'immagine di 40X NZCs LacZ + isolate da embrioni del ceppo Foxd1 LacZ, che esprime la β-galattosidasi sotto il controllo del promotore Foxd1. Foxd1 si esprime nella popolazione di cellule stromali all'interno della zona nefrogenico del rene di sviluppo. Le cellule sono state colorate con la F-actina marcatore falloidina (Oregon verde primario coniugato), il nucleare macchia DAPI (blu) e di coniglio anti-β-galattosidasi (secondaria - Alexa Fluor asino anti-coniglio 568) per il rilevamento di Foxd1 + cellule stromali ( rosso).
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Discussion
In questo protocollo si descrive un metodo per isolare le cellule e la cultura dalla zona nefrogenico del rene embrionale. E 'lo sviluppo di un metodo inizialmente pubblicato come parte di uno studio degli effetti del trattamento BMP7 sulle cellule della zona nefrogenica (Blank et al., 2009). Nello studio iniziale, una serie di esperimenti per caratterizzare i tipi di cellule rappresentate all'interno della popolazione NZC sono stati condotti. In breve, la purificazione della NZCs dei giornalisti genetica per lo stroma corticale (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini et al, 1996), dotto collettore (Hoxb7 + / CRE; R26 rEYFP) (Srinivas et al, 2001;. Yu et al. , 2002), e il tappo mesenchima (Bmp7 + / lacZ) (Godin et al., 1998) ha rivelato che circa il 35% di NZCs raccolte sono stroma corticale, il 52% sono mesenchima tappo e che la raccolta contaminazione condotto rappresenta meno dello 0,04%. Lineage marcatura esperimenti utilizzando il Bmp7 + / CRE; R26 rEYFP ceppo (Oxburgh et al, 2004;.. Srinivas et al, 2001) ha mostrato che circa il 10% NZCs possono essere cellule della linea mesenchima tappo che si sono differenziate e perso Bmp7 espressione . Studi di fattibilità con 7AAD ha mostrato un tasso di sopravvivenza a NZCs isolati di circa il 95%. Di recente abbiamo avuto successo nel separare sottopopolazioni di cellule all'interno NZCs attraverso l'ordinamento citometria a flusso. Tuttavia, la scarsità di associata alla membrana marcatori specifici per ciascuna delle sottopopolazioni di zona nefrogenico ha limitato queste analisi, e attualmente solo le cellule derivate da topi portatori dei geni marcatore fluorescente è fattibile.
L'efficacia di questo protocollo dipende in gran velocità nel passaggio dissezione. Sia la sopravvivenza delle cellule e la reattività per aumentare la stimolazione del fattore di crescita quando i reni rimanere in HBSS per brevi periodi di tempo prima che la digestione enzimatica. Un tempo di preparazione più brevi risultati quindi sia la vitalità delle cellule più alta e una risposta più robusta. Inoltre, bisogna fare attenzione quando si rimuove il supernatante dopo gira la sospensione cellulare come il pellet è facilmente disturbato con conseguente perdita di cellule significative.
Dal momento che il lavoro iniziale di Clifford Grobstein descrivere la cultura embrionale organo (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b), il rene è stato un sistema modello per l'organogenesi e l'interazione tra le cellule epiteliali e mesenchimali in fase di sviluppo. Recenti microanatomic studi sull'espressione genica hanno rivelato una complessità imprevista di tipi di cellule all'interno di ciascuno di questi comparti cellulari (Brunskill et al., 2008), e metodi complementari come la cultura NZC sono necessari per comprendere le interrelazioni tra queste cellule durante la nephrogenesis. Il fine ultimo delle nostre ricerche cellula principale è quello di definire le condizioni in cui le cellule zona nefrogenica può essere a tempo indeterminato espanse in vitro, sia per gli studi di nephrogenesis attecchimento e nell'adulto. Il sistema di coltura NZC è un passo importante verso questo obiettivo, e studi in corso nel nostro laboratorio scopo di definire i meccanismi di controllo della crescita di queste cellule.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da R01 DK078161 da NIDDK (LO), borse di studio post-dottorato da American Heart Association (AB), il Wenner-Gren Fondazioni di Svezia e Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Svezia (UB). Ulteriore supporto è stato fornito dal Maine Medical Center Research Institute strutture di base per Istopatologia, Bioinformatica e FACS (supportato da 2P20RR18789-06) e il Fondo per animali MMCRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
