Isolatie en Cultuur van Cellen van de nefrogene Zone van de embryonale Mouse Kidney

Summary

In dit rapport beschrijven we een methode voor de isolatie en de cultuur van de progenitor cel niche van de embryonale muis nier die gebruikt kan worden om signaalwegen reguleren van stam / voorlopercellen van de zich ontwikkelende nier te bestuderen. Deze gekweekte cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die een efficiënte manipulatie van de kandidaat-wegen mogelijk maakt.

Abstract

Embryonale ontwikkeling van de nier is reeds uitgebreid bestudeerd, zowel als een model voor epitheliale-mesenchymale interactie in organogenese en om begrip van de oorsprong van aangeboren nierziekte te krijgen. Meer recent heeft de mogelijkheid van sturing naïeve embryonale stamcellen in de richting van nefrogene lot onderzocht in de opkomende gebied van de regeneratieve geneeskunde. Genetische studies in de muis hebben een aantal wegen die nodig zijn voor nier-ontwikkeling, en een globale catalogus van gentranscriptie in het orgel is onlangs gegenereerd http://www.gudmap.org/ , het verstrekken van een groot aantal kandidaat-regulatoren van essentiële ontwikkeling functies. Organogenese van het knaagdieren nier kan worden bestudeerd in orgelcultuur, en vele rapporten hebben gebruik gemaakt van deze aanpak om de resultaten te analyseren van een van beide het toepassen van de kandidaat-eiwitten of slopen van de expressie van genen met behulp van siRNA of morpholinos. Echter, is de toepasselijkheid van de orgelcultuur op de studie van signalering die stam / voorlopercellen celdifferentiatie versus vernieuwing regelt in de ontwikkelingslanden nier beperkt gekweekte organen bevatten een compacte extracellulaire matrix het beperken van de verspreiding van macromoleculen en virusdeeltjes. Naar de cel signaleren gebeurtenissen die de stam / voorlopercellen cell niche in de nieren hebben we een primaire cel systeem dat de nefrogene zone of stamceltransplantatie niche van de zich ontwikkelende nier ex vivo los van de epitheliale inductor van differentiatie stelt invloed te bestuderen. Met behulp van beperkte enzymatische vertering, kan nefrogene zone cellen worden selectief bevrijd van de ontwikkeling van de nieren bij E17.5. Na filtratie, kunnen deze cellen worden gekweekt als een onregelmatige monolaag met behulp van optimale condities. Markergen analyse toont aan dat deze culturen een verdeling van celtypen kenmerk van de nefrogene zone in vivo bevatten, en dat ze te onderhouden bijbehorende markering genexpressie tijdens de cultuur periode. Deze cellen zijn zeer toegankelijk is voor kleine moleculen en recombinant eiwit behandeling, en vooral ook om virale transductie, die sterk vergemakkelijkt de studie van de kandidaat-stam / voorlopercellen cel regulator effecten. Fundamentele celbiologische parameters zoals proliferatie en celdood, alsook veranderingen in de expressie van moleculaire merkers kenmerk van nefron stam / voorlopercellen cellen in vivo kunnen succesvol gebruikt worden als experimentele resultaten. De lopende werkzaamheden in ons laboratorium het gebruik van deze nieuwe primaire cel techniek heeft tot doel te ontdekken basis mechanismen voor de regulatie van zelfvernieuwing versus differentiatie in nefron stam / progenitorcellen.

Protocol

1. Voorbereiden Reagentia voor Kidney spijsvertering

1. 1,5 ml van 0,25% Collagenase A (w / v) en 1% Pancreatine verteren (w / v) oplossing nodig zullen zijn voor de winning van nefrogene zone cellen (NZCs) vanaf 8 E17.5 nieren. Omdat Pancreatine duurt ongeveer 2 uur om op te lossen bij kamertemperatuur, voldoende verteren oplossing voor het grootste aantal van embryonale nieren verwachting dient voorafgaand aan het experiment worden gemaakt. Bereid verteren oplossing door eerst toevoeging van 25 mg Collagenase A tot Fosfaat 10 ml Dulbecco's gebufferde fysiologische zoutoplossing (DPBS) in een helder 15 ml, steriele centrifugebuis. Het is cruciaal dat de DPBS geen calcium of magnesium bevatten, want dit zal interfereren met de enzymatische verteren. Meng oplossing op een nutator gedurende 10 minuten op te lossen Collagenase A. 100 mg Pancreatine Voeg toe aan opgeloste Collagenase Een oplossing en mix op een nutator voor ten minste 2 uur. Als alternatief kan Collagenase A / Pancreatine digest-oplossing worden gemengd op een nutator overnacht bij 4 ° C. Het is raadzaam dat u een masker te dragen, als Collagenase A en Pancreatine gemakkelijk verspreiden in de atmosfeer tijdens de wegen en kan irriteren neus passages.
2. Bereid een 5% foetaal runderserum (FBS) (v / v) oplossing in een gebufferde zoutoplossing Hank's (HBSS). Omkeren om te mengen. 1 ml voor elke buis van 8 nieren zal nodig zijn.
3. Bereid kweekmedium door aan te vullen keratinocyten serum vrij medium met 1% glutamine (v / v) en 1% penicilline-streptomycine (Penstrep) (v / v).
4. Vacht steriele vlakke bodem polystyreen weefselkweek platen (96, 48, 24 of 6 goed) met menselijke fibronectine oplossing bij een concentratie van 5 mg per cm ² van de groei oppervlak. 5 mg van fibronectine poeder wordt geresuspendeerd in 5 ml steriele H ₂ O. Dit wordt verdund 1:25 in steriele DPBS zonder calcium of magnesium en 250 ml is toegevoegd aan elke well van een 24 wells plaat. Platen worden vervolgens geïncubeerd met fibronectine oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, gevolgd door 1 uur bij 4 ° C. Als alternatief kan plaatjes gedurende een nacht worden geïncubeerd bij 4 ° C. De oplossing wordt dan opgezogen in een laminaire stroming kap voorafgaand aan de toevoeging van medium / cellen.

2. Ontleden Nieren en verwijderen Capsules (uitgevoerd bij kamertemperatuur)

1. Bij E17.5, offeren de moeder met behulp van een procedure goedgekeurd door uw Institutional Animal Care en gebruik Comite, verwijder de baarmoeder, en plaats deze in een petrischaal met DPBS met calcium en magnesium. Onder een microscoop ontleden, gebruik horlogemakers een tang om elk embryo uit de baarmoeder en elk embryo onthoofden. Zodra de hele nest is uit de baarmoeder, transfer van de embryo's een schone petrischaal met daarin genoeg DPBS met calcium en magnesium volledig dekking van de embryo's met achterlating van zo veel bloed en weefsel puin mogelijk te maken.
2. Met behulp van een tang, een omtrek incisie in de buikwand van het embryo op het niveau van de navel. Plaats dan het embryo op zijn rug, pin het neer op de schouders met een set van de tang en verwijder de inwendige organen van de longen naar de blaas met behulp van de andere set tang. Met praktijk kan dit gebeuren in een beweging. De nieren moet worden gehecht aan de achterkant van de massa van organen. Als de nieren niet blijft vastzitten aan het ontdoen van de ingewanden organen, kunnen ze voorzichtig worden verwijderd uit het dorsale lichaamswand. Nieren die zijn beschadigd tijdens dit dissectie proces moet worden weggegooid omdat ze de laatste cultuur besmetten met ongepaste celtypen.
3. Voorzichtig plagen weg de nieren van de rest van de organen, en zorg ervoor dat de nieren met elkaar verbonden te houden. Houd het weefsel tussen de nieren met een set van pincet en pak de bijnier aan een van de nieren met de andere tang. De bijnier moet worden gehecht aan de nieren capsule. Haal voorzichtig de bijnier en de capsule uit de buurt van rond de buitenkant van de nier, vergelijkbaar met peeling een banaan. Zorg ervoor dat u de nier in tweeën, terwijl peeling, en zeker niet om de nier weefselbeschadiging onder de capsule worden. Verwijder voorzichtig alle resterende capsule evenals de urineleider als deze nog is aangesloten. Herhaal dit met de resterende nier.
4. Gebruik een afgezaagd overdracht pipet om de nieren te plaatsen in een 5 ml polystyreen buis van HBSS. Herhaal stap 2.2-2.4 voor elke embryo. Nieren kunnen worden samengevoegd 8 per tube. Met de praktijk, dissectie en verwijdering capsule duurt 2-3 minuten per embryo.

3. Enzymatische vertering van de nieren (Alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven)

1. Verwijder de HBSS oplossing van 5 ml buisjes met nieren met een pipet terwijl zorgvuldig vermijden van contact met de nieren. Onmiddellijk toevoegen 1,5 ml van Collagenase A / Pancreatine verteren oplossing voor de 5 ml buis met de nieren voordat u naar het volgende monster. Herhaal dit voor elke buis van de nieren.
2. Plaats de buisjes met enzym / nier verteert op een nutator in een voorverwarmde 37 ° C incubator gedurende 15 minuten. 2 minuten vóór devoltooiing van het verteren, voeg 3 pl DNase (1 U / ml) om een ​​verse 5 ml polystyreen buis voor elke vertering wordt uitgevoerd.
3. Verteert snel verwijderen van de incubator, voeg 75 ul van FBS en keer 3 keer te mengen. Laten staan ​​op de bank voor 2 minuten.
4. Overdracht 1,4 ml van de celsuspensie om de 5 ml polystyreen buis met DNase (1 U / ml), terwijl de resterende 0,2 ml celsuspensie en nieren achter. De extra 0,2 ml van de oplossing achtergelaten zal onzuiverheden zoals extracellulaire matrix bevatten.
5. Mix celsuspensie / DNase op een nutator in een voorverwarmde 37 ° C incubator gedurende 10 minuten.
6. Snel verwijderen celsuspensies van de incubator en overdracht elk een 1,5 ml Eppendorf buis. Spin celsuspensies in microfuge bij 325 g gedurende 5 minuten.
7. Verwijder supernatant van cel pellet en resuspendeer pellet in 1 ml van 5% FBS / HBSS, en neer te pipetteren 5 tot 6 keer. Cap elke buis voordat u naar het volgende monster.
8. Spin celsuspensies in een microcentrifuge bij 325 g gedurende 5 minuten.
9. Verwijder supernatant en voeg 0,5 ml van keratinocyten serum vrij medium (KSFM) met additieven aan elke buis en dop tube voordat hij naar het volgende monster. Na het medium is toegevoegd aan alle buizen, voorzichtig resuspendeer elke cel pellet door en neer te pipetteren 5 tot 6 keer met een 1 ml micropipet. Combineer alle celsuspensies in een frisse 5 ml polystyreen buis.
10. Pre-nat twee 40 micron cel-zeef caps geplaatst op een 5 ml polystyrol ronde bodem buis met KSFM per monster. Passeren celsuspensies door middel van een cel zeef cap door de overdracht met een 1 ml micropipet. Vermijd het aanraken van het filter met de pipetpunt. Verzamel doorstroming en herhaal filtratie door de tweede zeef dop. Verwijder de cel filter dop en te vervangen door een nieuwe pet van een normale 5 ml polystyreen buis.
11. Tellen cellen met een hemocytometer of een andere cel tellen apparaat en overdracht cellen aan putjes van een fibronectine gecoate cultuur plaat bij een dichtheid van 100,000-200,000 cellen per cm ^2, verdunnen indien nodig met KSFM met additieven. Over het algemeen halen we ongeveer 4.5x10 ⁶ cellen per 10 embryo nest.
12. Incubeer cellen in een 37 ° C bevochtigde incubator met 5% CO _2.
13. Laat cellen om te herstellen en voor 2-4 uur in middelgrote hechten voorafgaand aan de stimulatie met extra reagentia. Stimuleer cellen met samengestelde interest van 1 tot 48 uur. Zuiver RNA voor PCR analyse met behulp van de Qiagen RNeasy Micro Kit volgens de instructies van de fabrikant of volg de onderstaande instructies om fluorescent immunostain de cellen.

4. Voorbereiden Reagentia voor de fixatie van cellen en Immunokleuring

1. Bereid 4% PFA: Los 4% paraformaldehyde in PBS (v / v) bij 55 ° C met regelmatige agitatie. Afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Deze oplossing is giftig en moet worden weggegooid in aangewezen afvalcontainers.
2. Bereid permeabilisatie oplossing door toevoeging van Triton X-100 naar PBS tot een 0,3% (v / v) oplossing te verkrijgen.
3. Bereid een 5%-oplossing te blokkeren in PBS met serum van dezelfde soort als werd gebruikt om het secundaire antilichaam te gebruiken verhogen. Bijvoorbeeld, als u een konijn de opsporing van antilichamen tegen uw doelgroep antigeen met een ezel anti-Rabbit Alexa Fluor 568, bereiden een blokkerende oplossing met 5% ezel serum. Bewaren bij 4 ° C.
4. Bereid primaire antistof-oplossing door het toevoegen van de juiste concentratie van antilichaam aan 5% blokkeren oplossing.
5. Bereid secundair antilichaam oplossing direct voor gebruik. Voeg fluorofoor geconjugeerd antilichaam in de aanbevolen concentratie van de fabrikant, samen met de nucleaire tegenkleuring DAPI en andere organellen merkers zoals phalloidin tot 5% blokkeren oplossing. Indien opslag is niet vereist, houd oplossing in het donker bij 4 ° C tot gebruik.
6. Bereid 50% glycerol / PBS-oplossing (v / v) voor de opslag van immunostained cellen. Als alternatief kan Vectashield worden gebruikt.

5. Fixatie van cellen en Immunokleuring

1. Het volgende protocol is ontworpen voor fixatie en kleuring van NZCs in een 24 wells plaat. Gegeven volumes zijn voor een goed. Reagentia moeten voorzichtig worden gepipetteerd tijdens alle stappen om loslating van cellen te voorkomen, en de plaat opwinding wordt niet aanbevolen bij de incubatie stappen.
2. Voorzichtig verwijderen medium met een 1 ml micropipet en voeg 0,5 ml van 4% PFA bijgevoegde gekweekte cellen. Incubeer gedurende 15 minuten ongestoord bij kamertemperatuur.
3. Verwijder de 4% PFA en voeg 0,5 ml per putje van permeabilisatie oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
4. Verwijder permeabilisatie oplossing en voorzichtig twee keer spoelen met 0,5 ml PBS per spoelen.
5. Voeg 0,5 ml van het blokkeren van oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
6. Verwijder de blokkering oplossing en voeg 0,225 ml primair antilichaam oplossing.
7. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of overnacht bij 4 ° C.
8. Verwijder de primaire antistof-oplossing en voorzichtig riNSE tweemaal met 0,5 ml PBS per spoelen.
9. Voeg 0,225 ml secundaire antilichaam oplossing. Incubeer plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
10. Verwijder secundair antilichaam-oplossing en voorzichtig twee keer spoelen met 0,5 ml PBS per spoelen.
11. Voeg 0,3 ml 50% glycerol / PBS-oplossing (v / v) of genoeg Vectashield naar onderkant van goed bedekken.
12. Afbeelding cellen met epifluorescentiemicroscoop of op te slaan in folie gewikkeld bij 4 ° C.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1. NZCs werden gezuiverd van E17.5 embryo's, geplateerd op 200.000 cellen per cm ² en geïncubeerd bij 37 ° C voor een totaal van 24 uur. Cellen werden afgebeeld door de fase-contrast met een Leica DM IRB omkeermicroscoop voorafgaand aan de immunofluorescentie kleuring. (A) 20X fase contrast van NZCs na 24 uur in de cultuur. (B) Cellen werden gefixeerd en gekleurd met behulp van een konijn anti-PAX2 antilichaam specifiek voor nefron progenitor cellen (rood) en een secundaire Alexa Fluor 568 geconjugeerd ezel anti-Rabbit. Opmerking blauwe kernen tegengekleurd met DAPI. (C) 40X fase contrast van een cluster van nefron voorlopers (gecentreerd) na 24 uur in de cultuur. (D) 40X beeld van NZCs geïsoleerd van LacZ + embryo's van de Foxd1 ^LacZ stam, die β-galactosidase tot uitdrukking onder de controle van de Foxd1 promotor. Foxd1 wordt uitgedrukt in de stromale cel populatie binnen de nefrogene zone van de zich ontwikkelende nier. Cellen werden gekleurd met de F-actine marker phalloidin (Oregon groen primaire conjugaat), de nucleaire vlek DAPI (Blue) en konijn anti-β-galactosidase (secundair - Alexa Fluor ezel anti-Rabbit 568) voor de detectie van Foxd1 + stromale cellen ( rood).

Discussion

In dit protocol beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur cellen uit de nefrogene zone van de embryonale nier. Het is de ontwikkeling van een methode in eerste instantie gepubliceerd als onderdeel van een studie van de effecten van BMP7 behandeling op de cellen van de nefrogene zone (Blank et al.., 2009). In de eerste studie werden een reeks experimenten om de cel te typen vertegenwoordigd in de NZC populatie karakteriseren uitgevoerd. Kortom, zuivering van NZCs van genetische verslaggevers voor de corticale stroma (Foxd1 ^{+ / lacZ)} (. Hatini et al., 1996), het verzamelen van kanaal (Hoxb7 ^{+ / CRE;} R26 ^rEYFP) (Srinivas et al., 2001;. Yu et al.. , 2002), en dop mesenchym (Bmp7 ^{+ / lacZ)} (Godin et al.., 1998) bleek dat ongeveer 35% van de geoogste NZCs zijn corticale stroma, 52% zijn pet mesenchym en dat het verzamelen van kanaal besmetting minder dan 0,04%. Lineage markering van experimenten met de Bmp7 ^{+ / CRE;} R26 ^rEYFP stam (Oxburgh et al., 2004;.. Srinivas et al., 2001) toonde aan dat ongeveer 10% van NZCs kan zijn cellen van de kap mesenchym afkomst die zijn gedifferentieerd en verloren Bmp7 uitdrukking . Studie van de levensvatbaarheid met 7AAD toonde een overleving in geïsoleerde NZCs van ongeveer 95%. We hebben onlangs succesvol in het scheiden van cel subpopulaties binnen NZCs door middel van flowcytometrische sorteren. Echter, het gebrek aan membraan-geassocieerde markers die specifiek zijn voor elk van de subpopulaties van de nefrogene zone beperkt deze analyses, en op dit moment alleen cellen afkomstig van muizen die fluorescente marker-genen haalbaar is.

De effectiviteit van dit protocol is sterk afhankelijk van de snelheid in het ontleden stap. Zowel de overleving van cellen en de gevoeligheid voor groeifactor stimulatie te verhogen wanneer de nieren nog in HBSS voor een kortere periode van tijd voordat de enzymatische spijsvertering. Een kortere voorbereidingstijd resulteert dus zowel in het hoger levensvatbaarheid van de cellen en een meer robuuste reactie. Verder moet erop worden gelet bij het verwijderen van het supernatant na het draaien van de celsuspensie als de cel pellet is gemakkelijk verstoord resulteert in een significante cel verlies.

Sinds de eerste werk van Clifford Grobstein beschrijven van embryonale orgelcultuur (Grobstein, 1953a, Grobstein, 1953b), is de nier is een modelsysteem voor organogenese en de interactie tussen epitheliale en mesenchymale cellen in ontwikkeling. Recente microanatomic gen-expressie studies hebben aangetoond een onverwachte complexiteit van de celtypen binnen elk van deze cellulaire compartimenten (Brunskill et al.., 2008), en complementaire methoden, zoals NZC cultuur nodig zijn om de samenhang tussen deze cellen te begrijpen tijdens nefrogenese. Het uiteindelijke doel van onze primaire cel onderzoek is om te bepalen onder welke voorwaarden nefrogene zone cellen voor onbepaalde tijd kan worden in vitro uitgebreid, zowel voor studies van nefrogenese en innesteling in de volwassene. Het NZC cultuur-systeem is een belangrijke stap in de richting van dit doel, en lopende studies in ons laboratorium doel om de mechanismen van de groei te kunnen vaststellen in deze cellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Watchmaker’s forceps #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A	Roche Group	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin	Sigma-Aldrich	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin	BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
5mL polystyrene tubes	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer	BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Supplied as powder
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin	Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Use "DNase on column" protocol
Transfer pipettes, 3ml	BD Biosciences	357575