Summary
Neste relatório nós descrevemos um método para o isolamento e cultura do nicho de células progenitoras do rim do rato embrionárias que podem ser usadas para estudar vias de sinalização que regulam tronco / progenitoras células do rim em desenvolvimento. Estas células em cultura são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, que permite a manipulação eficiente das vias candidato.
Abstract
Desenvolvimento embrionário dos rins tem sido extensivamente estudado tanto como um modelo para a interação epitélio-mesenquimal em organogênese e conhecer melhor as origens da doença renal congênita. Mais recentemente, a possibilidade de direcção ingênua células-tronco embrionárias para destinos nefrogênica tem sido explorado no campo emergente da medicina regenerativa. Estudos genéticos no rato identificaram vários caminhos necessários para o desenvolvimento do rim, e um catálogo global da transcrição de genes do órgão foi recentemente gerado http://www.gudmap.org/ , proporcionando reguladores candidato inúmeras funções essenciais de desenvolvimento. Organogênese dos rins de roedores pode ser estudado em cultura de órgão, e muitos relatórios têm usado essa abordagem para analisar os resultados de qualquer aplicação de proteínas candidato ou derrubando a expressão de genes candidatos usando siRNA ou morpholinos. No entanto, a aplicabilidade da cultura de órgãos, para o estudo de sinalização que regula a haste / diferenciação de células progenitoras contra renovação no rim em desenvolvimento é limitado como órgãos de cultura contêm uma matriz de difusão compacto extracelular limitando de macromoléculas e partículas de vírus. Para estudar a sinalização celular eventos que influenciam a haste / nicho de células progenitoras no rim, temos desenvolvido um sistema de célula primária que estabelece a zona nefrogênica ou nicho de células progenitoras do desenvolvimento do rim vivo ex isoladamente o indutor da diferenciação epitelial. Usando a digestão enzimática limitada, as células da zona nefrogênica pode ser seletivamente liberada de desenvolver rins em E17.5. Após filtração, essas células podem ser cultivadas como uma monocamada irregular utilizando condições otimizadas. Análise gene marcador demonstra que essas culturas contêm uma distribuição de tipos de células característica da zona nefrogênica in vivo, e que mantêm a expressão do gene marcador apropriado durante o período de cultura. Estas células são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, o que facilita muito o estudo do candidato-tronco / progenitoras efeitos regulador celular. Parâmetros de células biológicas básicas, como a proliferação e morte celular, bem como alterações na expressão de marcadores moleculares característicos de néfron tronco / progenitoras células in vivo pode ser utilizado com sucesso como os resultados experimentais. Trabalhos em curso no nosso laboratório, utilizando esta técnica celular romance principal objetivo de descobrir os mecanismos básicos que regem a regulação da auto-renovação versus diferenciação no néfron tronco / progenitoras das células.
Protocol
1. Preparando Reagentes para Digestão Kidney
- 1,5 ml de colagenase 0,25% A (w / v) e 1% de solução pancreatina digerir (w / v) serão necessários para a extração de células da zona nefrogênica (NZCs) de 8 E17.5 rins. Porque Pancreatina leva aproximadamente duas horas para dissolver em temperatura ambiente, o suficiente digerir solução para o maior número de rins embrionários esperado deve ser feita antes do experimento. Prepare digerir solução primeiramente adicionando 25 mg de colagenase A a 10 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS) em 15 ml claro, tubo de centrifugação estéril. É fundamental que o DPBS não contém cálcio ou magnésio como isso irá interferir com a digestão enzimática. Misturar a solução em um nutator por 10 minutos para dissolver colagenase A. Adicionar 100 mg de pancreatina a colagenase Uma solução dissolvida e misture em um nutator por pelo menos 2 horas. Alternativamente, colagenase A / pancreatina solução para a análise pode ser misturado em um nutator overnight a 4 ° C. É recomendável que você usar uma máscara, como colagenase A e pancreatina dispersar facilmente para a atmosfera durante a pesagem e pode irritar as vias nasais.
- Prepare a 5% de soro fetal bovino (FBS) solução (v / v) em solução salina tamponada de Hank (HBSS). Inverter para misturar. 1 ml para cada tubo de 8 rins serão necessários.
- Prepare meio de cultura, completando meio de soro queratinócitos livre com glutamina 1% (v / v) e 1% penicilina-estreptomicina (PenStrep) (v / v).
- Revestimento estéril plano de fundo de poliestireno placas de cultura de tecido (96, 48, 24 ou 6 bem) com a solução de fibronectina humana a uma concentração de 5 mg por cm 2 de superfície de crescimento. 5 mg de pó de fibronectina é ressuspendido em 5 ml de H 2 O. estéril Este é diluído 1:25 em DPBS estéril sem cálcio ou magnésio e 250 ml é adicionado a cada poço de uma placa de 24 poços. As placas são então incubadas com solução de fibronectina em temperatura ambiente por uma hora seguido por uma hora a 4 ° C. Por outro lado, as placas podem ser incubadas overnight a 4 ° C. A solução é, então, aspirado em uma capela de fluxo laminar antes da adição de médio / células.
2. Rins de dissecação e remoção Cápsulas (feito à temperatura ambiente)
- No E17.5, o sacrifício da mãe através de um procedimento aprovado pelo seu Animal Care Institucional e Comitê de uso, remover o útero, e colocá-lo numa placa de Petri contendo DPBS com cálcio e magnésio. Sob um microscópio de dissecação, use relojoeiros 'fórceps para remover cada embrião do útero e decapitar cada embrião. Uma vez que toda a ninhada está fora do útero, a transferência dos embriões para uma placa de Petri limpa contendo DPBS suficiente com cálcio e magnésio para cobrir inteiramente os embriões deixando para trás tanto sangue e restos de tecido possível.
- Utilizando uma pinça, faça uma incisão circunferencial na parede abdominal do embrião no nível do umbigo. Em seguida, coloque o embrião em sua parte traseira, fixá-lo na altura dos ombros com um conjunto de pinças, e remover os órgãos internos dos pulmões até a bexiga usando o outro conjunto de fórceps. Com a prática isto pode ser feito em um único movimento. Os rins devem ser anexados na parte de trás da massa de órgãos. Se os rins não permanecer solidários com os órgãos eviscerados, eles podem ser cuidadosamente removida da parede do corpo dorsal. Rins que foram danificados durante o processo de dissecção deve ser descartada como eles vão contaminar a cultura final com tipos de células inadequado.
- Provocar suavemente afastado os rins do resto dos órgãos, tendo o cuidado de manter os rins ligados uns aos outros. Segure o tecido entre os rins com um conjunto de pinças e agarra a glândula adrenal anexado a um dos rins com a pinça outros. A glândula adrenal deve ser anexado à cápsula renal. Descascar delicadamente a glândula adrenal e da cápsula de distância ao redor do exterior do rim, semelhante ao descascar uma banana. Tome cuidado para não dividir o rim ao meio enquanto peeling, e não se esqueça para não danificar o tecido renal por baixo da cápsula. Remova cuidadosamente a cápsula restantes, bem como o ureter se ele ainda está conectado. Repita com o rim remanescente.
- Use uma pipeta de transferência de corte para colocar os rins em um tubo de poliestireno 5 ml de HBSS. Repita os passos de 2,2-2,4 para cada embrião. Rins podem ser agrupados de 8 por tubo. Com remoção de dissecação prática, e da cápsula levará 2-3 minutos por embrião.
3. A digestão enzimática de Rins (todas as etapas à temperatura ambiente exceto quando indicado)
- Remoção da solução HBSS de 5 ml contendo tubos de rins com uma pipeta, enquanto cuidadosamente evitando o contato com os rins. Imediatamente adicionar 1,5 ml de colagenase A / pancreatina solução para análise para o tubo de 5 ml contendo rins antes de passar para a próxima amostra. Repita o procedimento para cada tubo de rins.
- Colocar os tubos com a enzima / rim digere em um nutator em uma pré-aquecido a 37 ° C incubadora por 15 minutos. 2 minutos antes doconclusão do sumário, adicionar 3 mL de DNase (1 U / ml) para um novo tubo de poliestireno 5 ml para cada digerir sendo realizada.
- Remover rapidamente digere da incubadora, adicionar 75 mL de FBS e inverter 3 vezes para misturar. Deixe descansar no banco por 2 minutos.
- Transferência de 1,4 ml da suspensão de células para o tubo de poliestireno 5 ml contendo DNase (1 U / ml), deixando os restantes 0,2 ml suspensão de células e os rins para trás. O mL de solução 0,2 extras deixado para trás irá conter impurezas como matriz extracelular.
- Mix suspensão celular / DNase em um nutator em uma pré-aquecido 37 ° C incubadora por 10 minutos.
- Remover rapidamente suspensões de células da incubadora ea transferência de cada um para um tubo Eppendorf 1,5 ml. Suspensões de células de spin em microcentrífuga a 325 g por 5 minutos.
- Remover o sobrenadante de pellet celular e pellet ressuspender em 1 ml de 5% FBS / HBSS, pipetando para cima e para baixo 5 a 6 vezes. Cap cada tubo antes de passar para a próxima amostra.
- Girar suspensões de células em uma microcentrífuga a 325 g por 5 minutos.
- Remover o sobrenadante e adicionar 0,5 ml de meio de soro queratinócitos livre (KSFM) com aditivos para cada tubo e tubo de tampa antes de passar para a próxima amostra. Depois médio foi adicionado em todos os tubos, delicadamente ressuspender cada pellet de células por pipetagem cima e para baixo 5-6 vezes com uma micropipeta de 1 ml. Combine todas as suspensões de células em um novo tubo de poliestireno 5 ml.
- Pré-molhada dois 40 micron célula filtro-caps colocado em um tubo de poliestireno 5 ml de fundo redondo com KSFM por amostra. Passe suspensões de células através de uma tampa de filtro de célula, transferindo com uma micropipeta de 1 ml. Evite tocar o filtro com a ponta da pipeta. Colete de fluxo e repita filtração através da tampa do filtro segundo. Remova a tampa do filtro de células e substituir por uma nova tampa de um tubo de poliestireno normais 5 ml.
- Contagem de células com hemocitômetro ou outra célula dispositivo de contagem e células transferência para poços de uma placa de cultura fibronectina revestido a uma densidade de 100.000-200.000 células por cm 2, diluindo conforme necessário com KSFM com aditivos. Geralmente, nós recuperamos cerca de 4.5x10 6 células por 10 maca embrião.
- Incubar as células a 37 ° C incubadora umidificada com 5% de CO 2.
- Permitem que as células para recuperar e anexar por 2-4 horas em média antes da estimulação com reagentes adicionais. Estimulam as células com o composto de interesse para 1-48 horas. Purificar RNA para análise PCR usando o Qiagen RNeasy Micro Kit seguir as instruções do fabricante ou siga as instruções abaixo para fluorescente immunostain as células.
4. Preparando Reagentes para fixação das células e imunocoloração
- Prepare PFA 4%: Dissolver paraformaldeído 4% em PBS (v / v) a 55 ° C com agitação regular. Arrefecer à temperatura ambiente antes de usar. Esta solução é tóxico e deve ser descartado em contentores de lixo designados.
- Prepare a solução de permeabilização adicionando Triton X-100 a PBS para obter uma solução 0,3% (v / v).
- Prepare uma solução de 5% de bloqueio no PBS com soro da mesma espécie que foi usada para elevar o anticorpo secundário a ser usado. Por exemplo, se você vai detectar um anticorpo de coelho contra o antígeno do alvo com um burro anti-coelho Alexa Fluor 568, preparar uma solução contendo soro bloqueio burro de 5%. Armazenar a 4 ° C.
- Prepare a solução de anticorpo primário, adicionando a concentração adequada de anticorpos a 5% de solução de bloqueio.
- Prepare a solução de anticorpo secundário imediatamente antes da utilização. Adicionar anticorpos fluoróforo conjugado na concentração recomendada pelo fabricante juntamente com o contracorante nuclear DAPI e outros marcadores organela como phalloidin a 5% de solução de bloqueio. Se o armazenamento for necessário, manter a solução no escuro a 4 ° C até o uso.
- Prepare glicerol a 50% / solução de PBS (v / v) para o armazenamento de células imunocoradas. Alternativamente, Vectashield pode ser usado.
5. Fixação de Células e imunocoloração
- O protocolo a seguir é projetado para a fixação e coloração das NZCs em uma placa de 24 poços. Volumes indicados são para um único poço. Reagentes devem ser cuidadosamente pipetado durante todas as etapas para evitar desprendimento de células, e agitação placa não é recomendado nas etapas de incubação.
- Remova cuidadosamente com uma média 1 ml micropipeta e adicionar 0,5 ml de PFA 4% a células cultivadas em anexo. Incubar por 15 minutos sem perturbações à temperatura ambiente.
- Remover PFA 4% e adicionar 0,5 ml por poço de solução de permeabilização. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Remoção da solução de permeabilização e enxaguar levemente duas vezes com 0,5 ml de PBS por lavar.
- Adicionar 0,5 ml de solução de bloqueio e incubar em temperatura ambiente por 60 minutos.
- Remoção da solução de bloqueio e adicionar 0,225 ml de solução de anticorpo primário.
- Incubar à temperatura ambiente por 2 horas ou durante a noite a 4 ° C.
- Remoção da solução de anticorpo primário e gentilmente riNSE duas vezes com 0,5 ml de PBS por lavar.
- Adicionar 0,225 ml de solução de anticorpo secundário. Incubar placa no escuro em temperatura ambiente por 60 minutos.
- Remoção da solução de anticorpo secundário e enxaguar levemente duas vezes com 0,5 ml de PBS por lavar.
- Adicionar 0,3 ml de glicerol 50% / solução de PBS (v / v) ou Vectashield suficiente para cobrir parte inferior da superfície bem.
- Células de imagem com microscópio de epifluorescência ou armazenar embrulhados em papel a 4 ° C.
6. Resultados representante
Figura 1. NZCs foram purificados a partir de embriões E17.5, banhado em 200.000 células por cm 2 e incubados a 37 ° C para um total de 24 horas. As células foram fotografadas pela contraste de fase com um microscópio Leica DM IRB invertida antes da coloração de imunofluorescência. (A) 20X visão de contraste de fase de NZCs após 24 horas de cultura. (B) As células foram fixadas e coradas usando um anticorpo anti-coelho PAX2 específico para células progenitoras néfron (vermelho) e um secundário Alexa Fluor 568 conjugado burro anti-coelho. Nota núcleos azul contrastado com DAPI. (C) visão de contraste 40X fase de um grupo de progenitores néfron (centrado) após 24 horas de cultura. (D) a imagem de 40X NZCs isolado de LacZ + embriões da linhagem LacZ Foxd1, que expressa β-galactosidase sob o controle do promotor Foxd1. Foxd1 se expressa na população de células do estroma dentro da zona nefrogênica do rim em desenvolvimento. As células foram coradas com a F-actina marcador phalloidin (Oregon verde principal conjugado), o DAPI nuclear mancha (Azul) e de coelho anti-β-galactosidase (secundário - Alexa Fluor burro anti-coelho 568) para a detecção de células do estroma Foxd1 + ( vermelho).
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos um método para isolar e cultivar células da zona nefrogênica do rim embrionário. É o desenvolvimento de um método inicialmente publicado como parte de um estudo dos efeitos da BMP7 tratamento em células da zona nefrogênica (Blank et al., 2009). No estudo inicial, uma série de experimentos para caracterizar os tipos de célula representada dentro da população NZC foram realizados. Resumidamente, a purificação da NZCs dos repórteres genética para o estroma cortical (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini et al, 1996), duto coletor (Hoxb7 + / cre; R26 rEYFP) (Srinivas et al, 2001;. Yu et al. , 2002), e tampa mesênquima (Bmp7 + / lacZ) (Godin et al., 1998) revelou que aproximadamente 35% do NZCs colhidas são estroma cortical, 52% são mesênquima tampa e que a recolha de contaminação duto representa menos de 0,04%. Lineage marcação experimentos usando o Bmp7 + / cre; R26 rEYFP tensão (Oxburgh et al, 2004;.. Srinivas et al, 2001) mostrou que aproximadamente 10% dos NZCs podem ser células da linhagem mesênquima tampa que tem diferenciado e perdeu Bmp7 expressão . Estudos de viabilidade com 7AAD mostrou uma taxa de sobrevivência em NZCs isolada de aproximadamente 95%. Nós temos experimentado recentemente sucesso na separação de subpopulações de células dentro NZCs através de uma triagem de citometria de fluxo. No entanto, a escassez de membrana-associados marcadores específicos para cada uma das sub-populações da zona nefrogênica tem limitado as análises, e as células atualmente apenas derivados de camundongos portadores de genes marcador fluorescente é viável.
A eficácia deste protocolo depende muito da velocidade na etapa de dissecação. Tanto a sobrevivência da célula e capacidade de resposta ao crescimento aumentar a estimulação fator quando os rins permanecem em HBSS por períodos mais curtos de tempo antes da digestão enzimática. Um menor tempo de preparação, portanto, resulta tanto na viabilidade celular maior e uma resposta mais robusta. Além disso, é preciso ter cuidado ao remover o sobrenadante após girar a suspensão de células como o pellet celular é facilmente perturbado, resultando em significante perda celular.
Desde o trabalho inicial de Clifford Grobstein descrevendo a cultura de órgãos embrionários (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b), o rim foi um sistema modelo para a organogênese ea interação entre as células epiteliais e mesenquimais em desenvolvimento. Recentes estudos de expressão gênica microanatômica revelaram uma complexidade inesperada de tipos de células dentro de cada um desses compartimentos celulares (Brunskill et al., 2008), e métodos complementares como a cultura NZC são necessários para compreender a inter-relação entre estas células durante nephrogenesis. O objetivo final de nossas investigações célula principal é o de definir as condições em que as células da zona nefrogênica pode ser indefinidamente expandida in vitro, tanto para estudos de nephrogenesis e enxerto no adulto. O sistema de cultura NZC é um passo importante na direção desse objetivo, e estudos em curso no nosso objetivo de laboratório para definir os mecanismos de controle do crescimento destas células.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo R01 DK078161 de NIDDK (LO), bolsas de pós-doutorado da American Heart Association (AB), as Fundações Wenner-Gren da Suécia e Fysiografiska Kungliga Sällskapet, Lund, Suécia (UB). Apoio adicional foi fornecido pelo Maine Medical Center Research Institute instalações do núcleo de Histopatologia, Bioinformática e FACS (apoiado por 2P20RR18789-06) eo Biotério MMCRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
