Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Summary

I denna rapport beskriver vi en metod för isolering och odling av stamceller nisch från embryonala musen njuren som kan användas för att studera signalvägar som reglerar stamceller / progenitorceller av utvecklingsländerna njure. Dessa odlade celler är mycket tillgänglig för små molekyler och rekombinant protein behandling och viktigare även för viral transduktion, som möjliggör en effektiv hantering av kandidat vägar.

Abstract

Embryonala utvecklingen i njuren har studerats både som en modell för epitelceller-mesenkymala interaktion i organogenesen och få förståelse för ursprunget av medfödd njursjukdom. På senare tid har möjligheten att styra naiva embryonala stamceller mot nefrogen öden varit utforskas i det framväxande området regenerativ medicin. Genetiska studier på mus har identifierat flera vägar som krävs för njure utveckling, och en global katalog över gentranskription i orgeln har nyligen skapats http://www.gudmap.org/ , vilket ger många kandidat regulatorer av viktiga utvecklings-funktioner. Organbildande av gnagare njuren kan studeras i orgel kultur, och många rapporter har använt denna metod för att analysera resultaten av antingen tillämpa kandidat proteiner eller knacka ner uttrycket av gener med hjälp av siRNA eller morpholinos. Dock är tillämpningen av orgeln kultur för studier av signalering som reglerar stamceller / stamceller differentiering kontra förnyelse i utvecklingsländerna njure begränsad odlade organ innehåller en kompakt extracellulärmatrix att begränsa spridningen av makromolekyler och partiklar virus. För att studera cellsignalering händelser som påverkar stammen / stamcellstransplantation nisch i njuren har vi utvecklat en primär cell system som fastställer nefrogen zonen eller stamcellstransplantation nisch av utvecklingsländerna njure ex vivo i isolering från epiteliala inducerare av differentiering. Använda begränsat enzymatisk spjälkning kan nefrogen zon celler selektivt befrias från att utveckla njurarna vid E17.5. Efter filtrering kan dessa celler odlas som en oregelbunden cellslager använda optimerade förhållanden. Markörgen analys visar att dessa kulturer innehåller en fördelning av celltyper kännetecknande för nefrogen zonen in vivo, och att de upprätthåller lämpliga uttryck markörgen under kultur perioden. Dessa celler är mycket tillgänglig för små molekyler och rekombinant protein behandling och viktigare även för viral transduktion, vilket avsevärt underlättar studier av kandidat stam / progenitorceller effekter cell regulator. Grundläggande cell biologiska parametrar såsom proliferation och celldöd samt förändringar i uttryck av molekylära markörer kännetecknar nephron stam / progenitorceller in vivo kan med fördel användas som experimentella resultat. Pågående arbete i vårt laboratorium med hjälp av denna roman primärcell teknik syftar till att avslöja grundläggande mekanismer som styr regleringen av självförnyelse kontra differentiering nefronet stam / progenitorceller.

Protocol

1. Förbereda Reagens för Njure Digestion

1. 1,5 ml 0,25% kollagenas A (w / v) och 1% Pankreatin smälta (w / v) lösning kommer att behövas för utvinning av nefrogen zon celler (NZCs) från 8 E17.5 njurarna. Eftersom Pankreatin tar ca 2 timmar att lösa upp i rumstemperatur, nog smälta lösning för det största antalet embryon njurar förväntas göras före experimentet. Förbered smälta lösning genom att först lägga 25 mg kollagenas A till 10 ml Dulbecco är Fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) i en tydlig 15 ml, sterila centrifugrör. Det är viktigt att DPBS inte innehåller kalcium eller magnesium eftersom detta kommer att störa den enzymatiska smälta. Blanda lösning på ett nutator 10 minuter att lösa upp kollagenas A. Tillsätt 100 mg Pankreatin till löst kollagenas En lösning och blanda i en nutator i minst 2 timmar. Alternativt kan kollagenas A / Pankreatin smälta lösningen blandas på ett nutator över natten vid 4 ° C. Det rekommenderas att du bär en mask, som kollagenas A och Pankreatin skingras lätt i atmosfären vid vägning och kan irritera näsgångarna.
2. Förbered en 5% fetalt bovint serum (FBS) (v / v) lösning i Hanks buffrad koksaltlösning (HBSS). Invert för att blanda. 1 ml för varje rör av 8 njurar kommer att krävas.
3. Förbered odlingsmedium genom att komplettera keratinocyte serum fritt medium med 1% glutamin (v / v) och 1% Penicillin-streptomycin (PenStrep) (v / v).
4. Coat steril platta botten polystyren vävnadsodling plattor (96, 48, 24 eller 6 också) med mänskliga fibronektin lösning med en koncentration på 5 mg per cm ² av tillväxten yta. 5 mg fibronektin pulver är suspenderade i 5 ml sterilt H ₂ O. Detta späds 1:25 i steril DPBS utan kalcium-eller magnesium och 250 ml tillsätts i varje brunn på en 24 brunnar. Plattorna sedan inkuberas med fibronektin lösning i rumstemperatur i 1 timme följt av en timme vid 4 ° C. Alternativt kan plattorna inkuberas över natten vid 4 ° C. Lösningen är sedan aspireras i ett laminärt flöde huva före tillägg av medel / celler.

2. Analysera Njurar och ta bort kapslar (utföras vid rumstemperatur)

1. På E17.5, offra mamman med ett förfarande som godkänts av din Institutional Animal Care och användning kommittén, ta bort livmodern, och placera den i en petriskål med DPBS med kalcium och magnesium. Enligt en dissekera mikroskop, använder urmakare "pincett för att ta bort varje embryo från livmodern och halshugga varje embryo. När hela kullen är ut ur livmodern, överföra embryon till en ren petriskål som innehåller tillräckligt DPBS med kalcium och magnesium för att helt täcka de embryon lämna bakom så mycket blod och vävnad skräp som möjligt.
2. Använd pincett, gör en omkrets snitt i bukväggen av embryot i nivå med naveln. Placera sedan embryot på ryggen, stift ner till axlarna med en uppsättning av tång och ta bort de inre organen från lungorna ner till urinblåsan med den andra uppsättningen tång. Med lite övning kan detta göras i en rörelse. Njurarna ska fästas på baksidan av massan av organ. Om njurarna inte finns kvar på den urtagna organ, kan de försiktigt bort från rygg kroppen väggen. Njurar som har skadats under denna dissektion process bör kasseras eftersom de kommer kontaminera det slutliga kultur med olämpligt celltyper.
3. Försiktigt retas bort njurar från resten av organen, var noga med att hålla njurarna anslutna till varandra. Håll vävnaden mellan njurarna med en uppsättning av pincett och ta tag i binjuren knutna till en av njurarna med de andra pincett. Binjuren ska bifogas njuren kapsel. Dra försiktigt i binjuren och kapsel bort från runt utsidan av njuren, som liknar peeling en banan. Se till att inte dela njuren på mitten medan skalning, och vara säker på att inte skada njurvävnaden under kapseln. Ta försiktigt bort eventuella kvarvarande kapsel samt urinledaren om det fortfarande är ansluten. Upprepa med de resterande njure.
4. Använd en pipett klippa överföring till placera njurarna i en 5 ml polystyren tub av HBSS. Upprepa steg 2,2-2,4 för varje embryo. Njurarna kan slås samman 8 per rör. Med övning, dissektion och kapsel avskaffande kommer att ta 2-3 minuter per embryo.

3. Enzymatisk spjälkning av njurar (alla faser vid rumstemperatur ej annat anges)

1. Ta bort HBSS lösning från 5 ml rör med njurarna med en pipett och samtidigt noga undvika kontakt med njurarna. Tillsätt omedelbart 1,5 ml av kollagenas A / Pankreatin smälta lösning till 5 ml röret med njurar innan du går vidare till nästa prov. Upprepa för varje rör i njurarna.
2. Placera rören med enzymet / njure smälter på ett nutator i en förvärmda 37 ° C inkubator i 15 minuter. 2 minuter föreslutförandet av smälta, tillsätt 3 ìl DNase (1 U / ml) till en ny 5 ml polystyren rör för varje smälta som utförs.
3. Snabbt bort smälter ur inkubatorn, tillsätt 75 ìl av FBS och invertera 3 gånger för att blanda. Låt stå på bänken i 2 minuter.
4. Överför 1,4 ml av cellsuspension till 5 ml polystyren rör som innehåller DNas (1 U / ml) medan resterande 0,2 fjädring ml cell och njurarna bakom. De extra 0,2 ml lösning kvar kommer att innehålla föroreningar såsom extracellulärt matrix.
5. Blanda cellsuspension / DNas på en nutator i en förvärmda 37 ° C inkubator i 10 minuter.
6. Snabbt bort cellsuspensioner ur kuvösen och överföra vardera till ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Spin cellsuspensioner i mikrofugrör vid 325 gi 5 minuter.
7. Avlägsna supernatanten från cellpelleten och återsuspendera pelleten i 1 ml 5% FBS / HBSS, pipettera upp och ned 5 till 6 gånger. Cap varje rör innan du går vidare till nästa prov.
8. Spin cellsuspensioner i mikrocentrifug vid 325 gi 5 minuter.
9. Avlägsna supernatanten och tillsätt 0,5 ml keratinocyte serum fritt medium (KSFM) med tillsatser för att varje rör och lock röret innan du flyttar till nästa prov. När mediet har lagts till i alla slangar, försiktigt resuspendera varje cellpelleten genom att pipettera upp och ned 5 till 6 gånger med 1 ml mikropipett. Kombinera alla cellsuspensioner i en fräsch 5 ml polystyren rör.
10. Pre-våta två 40 micron cell-sil lock placeras på en 5 ml polystyren med rund botten rör med KSFM per prov. Pass cellsuspensioner genom en cell sil mössa genom att överföra med en 1 ml mikropipett. Undvik att röra filtret med pipettspetsen. Samla genomströmning och upprepa filtrering genom den andra sil locket. Ta av locket cellen silen och ersätta med en ny mössa från en normal 5 ml polystyren rör.
11. Räkna celler med en hemocytometer eller annan cell räknar enheten och celler överföring till brunnar i en fibronektin belagd odlingsplatta vid en densitet av 100,000-200,000 celler per cm ^2, späda vid behov med KSFM med tillsatser. Generellt hämtar vi ca 4.5x10 ⁶ celler per 10 embryo kull.
12. Inkubera cellerna i en 37 ° C fuktas inkubator med 5% CO _2.
13. Låt cellerna att återhämta sig och bifoga i 2-4 timmar i medelstora före stimulering med ytterligare reagens. Stimulera celler med sammansatt av intresse för 1 till 48 timmar. Rena RNA för PCR-analys med hjälp av Qiagen RNeasy Micro Kit enligt tillverkarens instruktioner eller följ instruktionerna nedan för att fluorescerande immunostain cellerna.

4. Förbereda Reagenser för fixering av celler och immunfärgning

1. Förbered 4% PFA: Lös 4% paraformaldehyd i PBS (v / v) vid 55 ° C med regelbunden omrörning. Svalna till rumstemperatur före användning. Denna lösning är giftigt och ska kasseras på anvisad avfallsbehållare.
2. Förbered permeabilization lösning genom att tillsätta Triton X-100 till PBS för att få en 0,3% (v / v) lösning.
3. Förbered en 5% blockerande lösningen i PBS med serum från samma art som användes för att höja sekundär antikropp som ska användas. Till exempel, om du kommer att upptäcka en kanin antikropp mot ditt mål antigen med en åsna anti-kanin Alexa Fluor 568, förbereda en blockerande lösningen innehåller 5% åsna serum. Förvaras vid 4 ° C.
4. Förbered primära antikroppen lösning genom att lägga till lämplig koncentration av antikroppar mot 5% blockerande lösningen.
5. Förbered sekundär antikropp lösning omedelbart före användning. Lägg fluoroforen konjugerade antikroppen vid tillverkarens rekommenderade koncentrationen tillsammans med den nukleära motfärg DAPI och annan organell markörer som phalloidin till 5% blockerande lösningen. Om förvaring krävs, hålla lösning i mörker vid 4 ° C fram till användning.
6. Förbered 50% glycerol / PBS lösning (v / v) för lagring av immunostained celler. Alternativt kan Vectashield användas.

5. Fixering av celler och immunfärgning

1. Följande protokoll är avsedd för fixering och färgning av NZCs i 24 brunnar. Ges volymerna för en enda bra. Reagens ska försiktigt pipetteras vid alla åtgärder för att undvika avlossning av celler och platta agitation rekommenderas inte i inkubationstiden steg.
2. Ta försiktigt bort medium med en 1 ml mikropipett och tillsätt 0,5 ml 4% PFA bifogad odlade celler. Inkubera i 15 minuter ostörd vid rumstemperatur.
3. Ta bort 4% PFA och tillsätt 0,5 ml per brunn permeabilization lösning. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
4. Ta bort permeabilization lösningen och försiktigt spola två gånger med 0,5 ml PBS per skölj.
5. Tillsätt 0,5 ml av blockerande lösningen och inkubera vid rumstemperatur i 60 minuter.
6. Ta bort blockerande lösningen och tillsätt 0,225 ml primära antikroppen lösning.
7. Inkubera vid rumstemperatur i 2 timmar eller över natten vid 4 ° C.
8. Ta bort primära antikroppen lösning och försiktigt riNSE två gånger med 0,5 ml PBS per skölj.
9. Tillsätt 0,225 ml sekundär antikropp lösning. Inkubera plattan i mörker vid rumstemperatur i 60 minuter.
10. Ta bort sekundär antikropp lösningen och försiktigt spola två gånger med 0,5 ml PBS per skölj.
11. Tillsätt 0,3 ml av 50% glycerol / PBS lösning (v / v) eller tillräckligt Vectashield för att täcka botten och yta.
12. Bild celler med epifluorescensmikroskop eller förvara inslagna i folie vid 4 ° C.

6. Representativa resultat

Figur 1. NZCs renade från E17.5 embryon, pläterade på 200 tusen celler per cm ² och inkuberas vid 37 ° C i totalt 24 timmar. Celler var avbildade med faskontrast med Leica DM IRB inverterat mikroskop före immunofluorescens färgning. (A) 20X faskontrast syn på NZCs efter 24 timmar i kulturen. (B) Cellerna var fasta och färgas med en kanin anti-PAX2 antikropp som är specifik för celler nefronet stamceller (röd) och en sekundär Alexa Fluor 568 konjugerat åsna anti-kanin. Observera blå kärnor counterstained med DAPI. (C) 40X faskontrast bild av ett kluster av nephron stamceller (centrerat) efter 24 timmar i kulturen. (D) 40X bilden av NZCs isolerade från LacZ + embryon av Foxd1 ^LacZ stam, som uttrycker β-galaktosidas under kontroll av de Foxd1 arrangören. Foxd1 uttrycks i stromaceller cellpopulation inom nefrogen zon utveckla njure. Cellerna färgades med F-aktin markör phalloidin (Oregon grön primär konjugat), Nuclear fläcken DAPI (blå) och kanin anti-β-galaktosidas (sekundär - Alexa Fluor åsna anti-kanin 568) för detektion av Foxd1 + stromaceller ( röd).

Discussion

I detta protokoll beskriver vi en metod för att isolera och odla celler från nefrogen zon av embryonala njure. Det är utvecklingen av en metod som ursprungligen publicerades som en del av en studie av effekterna av BMP7 behandling på cellerna i nefrogen zonen (Blank et al., 2009). I den första studien var en serie experiment för att karakterisera celltyperna representerade inom NZC befolkningen genomförts. Kortfattat, rening av NZCs från genetiska reportrar för kortikala stroma (Foxd1 ^{+ / lacZ)} (. Hatini et al, 1996), samla kanal (Hoxb7 ^{+ / CRE,} R26 ^rEYFP) (Srinivas et al, 2001;. Yu et al. , 2002), och mössa mesenkym (Bmp7 ^{+ / lacZ)} (Godin et al., 1998) visade att ca 35% av skördade NZCs är kortikal glatta, 52% är cap mesenkym och att samla in kanal föroreningar utgör mindre än 0,04%. Lineage märkning experiment med Bmp7 ^{+ / CRE,} R26 ^rEYFP stam (Oxburgh et al, 2004;.. Srinivas et al, 2001) visade att ca 10% av NZCs kan vara celler i den gemensamma jordbrukspolitiken mesenkym härstamning som har differentierade och förlorat Bmp7 uttryck . Livskraft studier med 7AAD visade en överlevnad i isolerade NZCs på cirka 95%. Vi har nyligen upplevt framgång i separera celler subpopulationer inom NZCs genom flödescytometrisk sortering. Däremot har bristen på membran-associerade markörer som är specifika för var och en av delpopulationer av nefrogen zonen begränsad dessa analyser, och för närvarande endast celler från möss som bär fluorescerande markörgener är genomförbart.

Effekten av detta protokoll beror mycket på fart i dissekera steg. Både cellöverlevnad och lyhördhet för tillväxtfaktor stimulering ökar när njurarna kvar i HBSS för kortare perioder innan enzymatisk spjälkning. En kortare förberedelsetid leder alltså både till högre cellviabiliteten och en mer robust svar. Dessutom måste man vara försiktig när du tar bort supernatanten efter centrifugering cellsuspensionen som cellpelleten är lätt störd resulterade i betydande cell förlust.

Sedan den första arbete Clifford Grobstein beskriva embryonala orgel kultur (Grobstein, 1953a, Grobstein, 1953b) har njuren varit en modell för organogenesen och samspelet mellan epiteliala och mesenkymala celler i utvecklingen. Nyligen microanatomic genuttryck studier har visat en oväntad komplexitet celltyper inom dessa cellens (Brunskill et al., 2008), och kompletterande metoder såsom NZC kultur krävs för att förstå sambandet mellan dessa celler under nephrogenesis. Slutmålet för vår primära cell undersökningar är att definiera villkoren för nefrogen zon celler kan på obestämd tid expanderat in vitro både för studier av nephrogenesis och engraftment i den vuxna. Det NZC kulturen är ett viktigt steg mot detta mål, och pågående studier i vårt laboratorium syftar till att definiera de mekanismer tillväxt kontroll i dessa celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Watchmaker’s forceps #5	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A	Roche Group	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin	Sigma-Aldrich	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg	Lonza Inc.	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)	BioWhittaker	14-901E
HBSS	GIBCO, by Life Technologies	14175
KSFM	GIBCO, by Life Technologies	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM	Sigma-Aldrich	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml	Sigma-Aldrich	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin	BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca	Lonza Inc.	17-512F
5mL polystyrene tubes	BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)	Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer	BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100	VWR international	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS	Sigma-Aldrich	P3813	Supplied as powder
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2	Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal	MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin	Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI	Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Glycerol	EMD Millipore	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	Use "DNase on column" protocol
Transfer pipettes, 3ml	BD Biosciences	357575