Summary
توضح هذه المقالة أسلوب قياسي للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء الجزيئات البيولوجية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ السلبية (EM). في هذا البروتوكول ، ونشرح كيفية الحصول على هيكل 3D من exosome السكيراء مجمع البيرة في قرار عشوائي المتوسطة باستخدام أسلوب إعادة الإعمار الميل المخروطية (RCT).
Abstract
واحد المجهر الإلكتروني الجسيمات (EM) إعادة الإعمار وأصبح أداة شعبية في الآونة الأخيرة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. بالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية ، فإنه لديه بعض مزايا فريدة. أول واحد الجسيمات EM إعادة الإعمار ليست في حاجة لبلورة نموذج البروتين ، والذي هو عنق الزجاجة في البلورات بالأشعة السينية ، وخاصة بالنسبة للمجمعات الجزيئات الكبيرة. وثانيا ، أنها لا تحتاج إلى كميات كبيرة من عينات البروتين. بالمقارنة مع ملليغرام من البروتينات اللازمة لبلورة واحدة التعمير EM يحتاج فقط الجسيمات الدقيقة عدة لترات من محلول البروتين في تركيزات نانو المولي ، وذلك باستخدام أسلوب تلطيخ السلبية EM. ومع ذلك ، على الرغم من الجمعيات القليلة التي تماثل الجزيئات عالية ، جسيم واحد هو EM محدودة في دقة منخفضة نسبيا (أقل من 1 نانومتر القرار) لعينات كثيرة لا سيما تلك دون التماثل. وتقتصر هذه التقنية أيضا حسب حجم الجزيئات قيد الدراسة ، أي 100 كيلو دالتون لعينات الملون سلبيا و300 كيلو دالتون لعينات مجمدة رطب بشكل عام.
لعينة جديدة من الهيكل غير معروف ، ونحن عموما استخدام المعادن الثقيلة حل لتضمين الجزيئات التي تلطيخ السلبية. ثم يتم فحص العينة في انتقال مجهرا الكترونيا لاتخاذ ثنائي الأبعاد (2D) micrographs من الجزيئات. من الناحية المثالية ، وجزيئات البروتين وبنية متجانسة 3D كنه يحمل توجهات مختلفة في micrographs. يتم ترقيم هذه micrographs ومعالجتها في أجهزة الكمبيوتر باسم "الجزيئات واحدة". ثنائي الأبعاد باستخدام المحاذاة وتقنيات التصنيف ، تتجمع جزيئات متجانسة في نفس وجهات النظر إلى طبقات. المتوسطات على تعزيز إشارة من الأشكال الجزيء 2D. بعد أن تعيين جسيمات ذات التوجه النسبي الصحيح (زوايا أويلر) ، سنكون قادرين على إعادة بناء الصور في حجم الجسيمات 2D 3D ظاهري.
في واحد الجسيمات 3D إعادة الإعمار ، هو خطوة ضرورية لتعيين بشكل صحيح التوجه السليم لكل جسيم واحد. هناك عدة طرق لتعيين عرض لكل جسيم ، بما في ذلك إعادة الزاوي (1) والميل عشوائي المخروطية (RCT) الأسلوب 2. في هذا البروتوكول ، وصفنا ممارستنا في الحصول على إعادة الإعمار 3D المعقدة باستخدام الخميرة exosome السلبية EM تلطيخ وRCT. وتجدر الإشارة إلى أن لدينا بروتوكول المجهر الإلكتروني ومعالجة الصور يتبع المبدأ الأساسي لRCT ولكن ليست الطريقة الوحيدة لتنفيذ هذه الطريقة. علينا أولا كيف تصف لتضمين عينة البروتين إلى طبقة من ثاني اكسيد اليورانيوم فورمات - بسماكة مماثلة لحجم البروتين ، وذلك باستخدام الشبكة الكربون holey مغطاة بطبقة من الكربون رقيقة فيلم المستمر. ثم يتم إدخال العينة إلى انتقال مجهرا الكترونيا لجمع untilted (0 درجة) ويميل (55 درجة) زوجا من micrographs التي سيتم استخدامها لاحقا لتجهيز والحصول على النموذج الأولي لل3D exosome الخميرة. ولهذه الغاية ، نقوم RCT ثم صقل النموذج الأولي 3D باستخدام طريقة الإسقاط مطابقة التنقيح 3.
Protocol
1. مبدأ أسلوب الخيمة المخروطية عشوائية
- مبدأ أسلوب الميل المخروطية عشوائية يتطلب اتخاذ زوج من micrographs من نفس المنطقة من العينات داخل المجهر الالكتروني. يتم أخذ صورة واحدة من العينة في موقف untilted (الشكل 1A) ، ويتم أخذ صورة أخرى من العينة يميل بزاوية تتراوح بين 50 إلى 70 درجة (في حالتنا ، ونحن نستخدم 55 درجة). (الشكل 1B)
- باستخدام الكمبيوتر ، يتم وضع الزوج مجهرية رقمية جنبا إلى جنب والصور من الجزيئات هي نفسها المحددة. (الشكل 1C)
- في ثلاثي الأبعاد الإحداثيات ، وترتبط هذه الصور من جسيمات untilted وشركائها يميل إلى بعضها البعض من خلال اتجاه محور الإمالة وزاوية الميل. (1D الشكل)
- محاذاة الصور الجسيمات untilted يجلب الصور من الجزيئات تميل إلى مواقعها السمتي المطابق. (الشكل 1E)
- استخدام صور متعددة من الجزيئات تميل ملء الفضاء السمتي ، يمكن بناؤها على هيكل ثلاثي الأبعاد للجزيء باستخدام خوارزمية الخلفية الإسقاط. (الشكل 1F)
الشكل 1. مثال على هذا المبدأ لاعادة اعمار RCT.
2. إعداد الشبكات من الكربون Holey غطوا مع الكربون رقيقة
الأساس المنطقي : نحن نستخدم أسلوب تلطيخ السلبية لإصلاح عينة عشوائية من البروتين لاعادة الاعمار الميل المخروطية. من أجل الحفاظ على الجزيئات دون تسطيح الكثير أثناء التجفيف ، ونحن نحاول تضمين جزيئات البروتين في وصمة عار عميق مع سمك حول البعد من البروتينات 4. بشكل عام ، يستخدم الكربون المستمر في صنع عينات الملون سلبيا. هذا النوع من الكربون ، ولكن من الصعب التحكم في سمك ملون حول جزيئات البروتين. ونحن بالتالي استخدام شبكات محلية الصنع الكربون holey مغطاة بطبقة رقيقة من الكربون فيلم (~ سمك نانومتر 5) لجعل العينات الملون سلبيا. يذكر الآبار التي شكلتها ثقوب تسمح الإبقاء على البروتين الحل والحل وصمة عار على الشبكة بحيث يصبح الامر اكثر سهولة لتضمين البروتين في السمك an صمة الأمثل. وعلاوة على ذلك ، وطبقة رقيقة من الكربون خلال ثقب يقلل من الضوضاء في الخلفية بشكل كبير.
- إعداد 0.5 ٪ Formvar حل. في غطاء الدخان ، إضافة 0.45 راتنج البولي فينيل ز رسمية و 90 مل كلوروفورم في كوب زجاج مل 100. استخدام رقائق الألومنيوم لتغطية الكأس ، واستخدام بقضيب الصغيرة للمساعدة في حل راتنج رسمية بشأن مغناطيسي. يستغرق حوالي 15 دقيقة ليحل الراتنج.
- أثناء تفكك Formvar ونظيفة الزجاج المجهري الشرائح في الميثانول ويمسح الجاف مع Kimwipes.
- بعد حله تماما راتنج Formvar في الكلوروفورم ، إضافة 1 مل من الجلسرين 50 ٪ إلى السطح من الحل. ضبط حجم الجلسرين وأضاف يؤثر على كثافة الثقوب على holey الكربون. تراجع غيض من ultrasonicator في الحل على عمق حوالي 1 بوصة واستخدام القوة القصوى ليصوتن 1 دقيقة لجعل مستحلب من قطرات في محلول الجليسرول Formvar. الحل حليبي يصبح بعد هذه الخطوة. تعد الأسباب صوتنة حجم أصغر من الثقوب على holey الكربون.
- مباشرة بعد صوتنة ، وتراجع الشرائح الزجاجية تنظيفها عموديا في المستحلب لمدة 1 ثانية ، تأخذ بها ، وصمة عار قيعان الشرائح 'على استعمال ورق الترشيح لتشكيل الفيلم بلاستيكية رقيقة على سطح الشرائح. بعد choloroform يتبخر ، والتحقق من كثافة وحجم الثقوب في فيلم تحت المجهر الخفيفة. ضبط حالة إعداد وفقا للاحتياجات. مع الشرط الموصوفة هنا ، ونحن عموما الحصول على ثقوب بقطر 3 أمتار ~ الدقيقة 4 و 10 ~ 20 ثقوب في كل مربع من شبكة سلكية 400.
- بعد الشرائح الزجاجية والجافة ، وقطع حافة الفيلم من البلاستيك على سطح الشريحة. تعويم فيلم خارج على سطح الماء المقطر. ويمكن لاحظت طبقة رقيقة على سطح الماء في زاوية نظرة عابرة على انعكاس الضوء. مكان شبكات سلكية النحاس 400 على الفيلم واحدا تلو الآخر ، مع سطح شبكات 'السلس أسفل.
- يلتقط الفيلم البلاستيكية بشبكات عليها باستخدام قطعة من الورق. الوجه ورقة واتركها تجف في طبق بتري. امتصاص الميثانول في ورقة لإزالة الجلسرين المتبقية في الحفر وترك ورقة جافة في الهواء.
- معطف شبكات بطبقة من الكربون مع سمك النانومتر 20 ~ في المبخر الكربون. ويمكن تحديد سمك من اللون الرمادي من الكربون.
- تنقع مع شبكات الكربون في الكلوروفورم لمدة نصف ساعة لإزالة Formvar. بعد تجفيف شبكات ، لقد حصلنا على شبكات محلية الصنع holey الكربون.
- تتبخر طبقة رقيقة من الكربون مع حوالي 5 نانومتر في السمك على سطح الميكا المشقوق حديثا.
- وضعت بعناية شبكات الكربون holey تحت الماء المقطر. تعويم الكربون رقيقة من سطح الميكا على سطح الماء وإيداعه على الكربون holeyشبكات ببطء. تجفيف شبكات في غطاء الدخان.
3. تلوين سلبي مجمع Exosome
الأساس المنطقي : هناك عدد غير قليل من المعادن الثقيلة وصمة عار الحلول التي يمكن أن تستخدم لتلوين EM السلبية ، بما في ذلك خلات اليورانيل ، فورمات اليورانيل ، وحامض الفسفوتنغستيك ، موليبدات الأمونيوم ، وغيرها. حل صمة مختلفة لها خصائص فريدة من نوعها مختلفة. على سبيل المثال ، خلات اليورانيل يوفر التباين العالي للجسيمات ولكن قد يتلف مجمعات البروتين الذي لا يحبون البيئة الحمضية. لتلك العينات ، قد حمض phosphotungestic عند pH محايدة يكون حلا جيدا وصمة عار. نختار المشبعة فورمات ثاني اكسيد اليورانيوم (UF) حل لها بسبب التفاصيل الدقيقة وقدرة اختراق عالية الجزيئات.
- غلي الماء المقطر لمدة 1 دقيقة. تبريده ببطء إلى درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة هي لإزالة الأكسجين الذائب من الماء.
- جعل الطازجة فورمات 2 ٪ ثاني اكسيد اليورانيوم (UF) حل. مزيج 1 مل من الماء و 20 UF ملغ في أنبوب مل 1.5. دوامة لمدة 10 دقيقة.
- ضبط قيمة الرقم الهيدروجيني إلى 5.0 بإضافة 2 ميكروليتر من هيدروكسيد البوتاسيوم 10 م. المزيج على الفور. ينبغي أن يكون الحل أكثر اللون الأصفر. الرقم الهيدروجيني من الحل يجب أن لا تكون مرتفعة للغاية ، وإلا وصمة عار رواسب.
- وضع أنبوب على vortexer لمدة 10 دقيقة.
- تدور الحل على سطح المكتب جهاز للطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة.
- تصفية الحل عن طريق الغشاء PVDF 0،2 ميكرون. هذا هو الحل UF الطازجة. تغطية أنبوب حل في قطعة من رقائق الألمنيوم لمنع الضوء. الحل يجب أن تستخدم في نفس اليوم.
- تصريف توهج يكون رفيعا جدا من الكربون ، الإفراط في holey الشبكة الكربون باستخدام جهاز توهج التفريغ لمدة 30 ثانية عند 25 أمبير الحالية.
- وضع قطعة من parafilm نظيفة على مقاعد البدلاء. وضع 3 قطرات من 50 ميكروليتر حل الجبهة المتحدة وصمة عار على رأس parafilm.
- تمييع مجمع exosome إلى تركيز من 50 نانومتر 100 ~ باستخدام العازلة تخفيف (25 ملي تريس - 7.5 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك ، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 2 مم DTT). وضع 4 ميكروليتر من البروتين المخفف على الشبكة ، يتوهج تصريفها. اسمحوا العينة البقاء على الشبكة لمدة دقيقة واحدة. (ملاحظة : هذا التركيز النهائي للجزيئات يعطي عموما في كثافة الأمثل للالموزعة توزيعا جيدا الجسيمات على الشبكة للحصول على ملطخة سلبا أو فورمات اليورانيل اليورانيل حل acecate صمة عار ، والفوسفات أو تركيزات عالية من الملح (أكثر من 0.5 م) في العام ليست جيدة للحصول على نتائج جيدة تلطيخ. تجربتنا تشير إلى أن Hepes أو مواسير تعمل بشكل جيد مع حلول اليورانيل صمة عار).
- استخدام قطعة من ورق الترشيح لطخة الحل المتبقي من على حافة الشبكة والوجه الشبكة مباشرة على الجزء العلوي من قطرات صمة عار وشطف الشبكة لمدة 10 ثوان على كل قطرة.
- بعد شطف الماضي ، والسماح للبقاء وصمة عار على الشبكة لمدة دقيقة (1) وصمة عار وصمة عار ثم بعيدا من قطعة من ورق الترشيح. الحفاظ على طبقة رقيقة من الحل وصمة عار على سطح الشبكة من أجل الحصول على نتائج جيدة وصمة عار عميق. السماح لشبكة تجف بسرعة في غطاء الدخان.
4. الإلكترون المجهر مجمع Exosome
الأساس المنطقي : يمكن استخدام أي انتقال مجهرا الكترونيا مع مرحلة تميل لجمع أزواج الميل للعينة لإعادة الإعمار RCT. من الناحية النظرية ، يمكن إمالة أعلى الزاوية العينة لجمع البيانات ، كلما كان ذلك أفضل. في الممارسة العملية ، ويرجع ذلك إلى تصميم لصاحب العينة وهندسة الشبكة ، هو أقصى زاوية محدودة قابلة للتشغيل 50-70 درجة مئوية. في هذا البروتوكول ، ونحن لدينا وصف الإجراء فقط باستخدام Tecnai - 12 المجهر الالكتروني الاتحاد الدولي للفروسية. لنماذج أخرى من المجاهر ، والعمليات يجب أن يتم تعديلها وفقا لمتطلبات المشروع وممتلكات الصك.
- وضع الشبكة في نموذج صاحب العينة ومن ثم وضع حامل في مجهر الاتحاد الدولي للفروسية Tecnai الإلكترون -12. ويتم تشغيل المجهر عند 120 كيلو فولت. نستخدم كاميرا CCD Ultrascan4000 غاتان لالتقاط الصور. تأكد من أن "انعكاس حول محور عمودي" في الحوار "الكاميرا التكوين" واجهة رقمية صورة مجهرية غير محددة لضمان تحديد الإنصاف الصحيح. (ملاحظة : هذا أمر مهم خاصة إذا كان القارئ يعتمد على إجراءات إعادة الإعمار سبايدر RCT للحصول على نموذج 3D)
- فحص عينة الشبكة في التكبير منخفضة للعثور على أفضل المربعات الملون. وينبغي أن مثل هذا النوع من الساحات لديها عشرات من الثقوب مع البعد من حوالي 1 ~ 2 ميكرومتر والمناطق المظلمة وصمة عار في نفوسهم. (الشكل 2)
الشكل 2 ألف صورة مجهرية التكبير المنخفض للعرض على شبكة المربعات مع بقع جيدة وأخرى سيئة. - بدوره على وضع جرعة منخفضة من واجهة المستخدم الاتحاد الدولي للفروسية ومواءمة البحث والتركيز وفضح الموقف في وضع جرعة منخفضة. نستخدم تكبير من 150000 الى التركيز والتعرض ل52000 و 1.5 متر في طول الكاميرا حيود للبحث. يتم ضبط الوقت التعرض ل1 ثانية. تعيين التركيز الموضع 2 ميكرومتر بعيدا عن التعرض نقاط البيعition على طول محور إمالة.
- العثور على ثقوب مع تلوين جيدة في وضع البحث ، وحفظ المواقع. الثقوب جيدة عموما التدرج وصمة عار في الظلام لاحظ لهم في ظل وضع البحث. التقاط صورة لاتفاقية مكافحة التصحر مربع. إمالة العينة إلى 55 درجة ، والتقاط صورة أخرى. قارن بين الصورتين ، وتحديد الثغرات في إقران micrographs اثنين. (الشكل 3)
الشكل 3 ألف ميل الزوج micrographs من مربع بحث في الوضع. يشار إلى الثقوب المقابلة المقترنة. - إمالة المرحلة إلى 0 درجة. استخدام عدة جرعة منخفضة لالتقاط الصور من كل ثقب المحددة في وضع البحث في التكبير عالية. ويزيل التباؤر تستخدم حوالي -0.7 ميكرون.
- بعد أن تم اتخاذ جميع الثقوب صور ، والميل المرحلة إلى 55 درجة. أخذ عينة من micrographs إمالة التكبير في نفس تلك untilted مع يزيل التباؤر من حوالي -1.2 ميكرون. تحديد المقابل يميل أزواج من micrographs استنادا إلى الأنماط في micrographs التكبير منخفضة. نمط غير منتظم من شبكات محلية الصنع الكربون holey يساعد الارتباط. دراسة أزواج ميل micrographs وإزالة البقع مع micrographs سيئة مثل المناطق الضحلة الملون (جسيمات ويبدو أن الهالة المحيطة بهم تحت ظروف إمالة). الشكل (4)
الشكل 4. اثنان من أزواج الميل micrographs للعينة في التكبير عالية. يتم وضع علامة على micrographs جيدة وأخرى سيئة.
5. معالجة الصور من البيانات
الأساس المنطقي : هناك خيارات مختلفة وحزم البرامج لتنفيذ إعادة الإعمار RCT في الكمبيوتر. والأكثر استخداما عموما هو سبايدر 5. ويمكن الاطلاع على بروتوكول الأساسية لأداء RCT في سبايدر في صفحة الويب http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html . ووصف مفصل لتنفيذ بروتوكول RCT في سبايدر في المقالة التي كتبها الشيخ وآخرون (6) وبروتوكول لدينا ، ونحن نستخدم مزيج من IMAGIC - 5 7 و سبايدر في إصدار شريط فيديو للبروتوكول. كما نقوم بتوفير إجراء بديل لاستخدام سبايدر فقط في إصدار نص البروتوكول.
- الإعداد للبرامج. نستخدم proc2d في حزمة 8 EMAN لتغيير شكل صورة من الصور الرقمية إلى تنسيق غاتان صورة سبايدر. يستخدم IMAGIC - 5 للقيام 2D المحاذاة. يستخدم سبايدر للقيام الإعمار 3D والصقل.
القسم الفرعي 1 : اختيار أزواج ميل الجزيئات.
- تحويل الصور الرقمية *. DM3 غاتان لتنسيق صورة سبايدر به الأمر في proc2d EMAN. تتم تسمية أزواج وإمالة untilted في نمط و*** *** t.spi وu.spi ، على التوالي.
- اختيار أزواج الجسيمات باستخدام برنامج "WEB" وزعت في حزمة برنامج سبايدر. اتبع التعليمات في الإحداثيات يتم حفظها اوتوماتيكيا في DCU ***. SPI وDCT SPI ***. للجسيمات untilted ومالت على التوالي. وثيقة أخرى DCB ***. SPI يحتوي على المعلومات زاوية الميل بين الجسيمات وإمالة untilted (ملاحظة : الزوايا الثلاث خلال المناسب في WEB بين أزواج الميل لا تضمن الإنصاف الصحيح لإعادة الإعمار النهائية بسبب ثيتا ليس لديها توقيع (قيمة موجبة) وفاي وغاما تعتمد على مجموعة القيم الأولية لهم. فحص اتجاه الانحدار يزيل التباؤر على صورة مجهرية إمالة من شأنه أن يساعد تعيين القيم الصحيحة الأولي للفاي وغاما قبل المناسب من أجل الحصول على تصحيح الإنصاف في الشكل إعادة الإعمار. 5 يوضح الاتفاقية الصحيح).
الشكل 5. رسم توضيحي لشرح اتفاقية تقرير الجسيمات في زاوية الميل بين زوج WEB اختيار النمط المناسب يحدده يزيل التباؤر الانحدار. H يمثل عالية يزيل التباؤر المنطقة بينما يمثل L المنخفضة يزيل التباؤر المنطقة. السهم يمثل محور إمالة. يشار إلى أن المقابلة الأولي الصحيح لزوايا وGAMMA PHI لكل مخطط. - مربع من الجسيمات التي يتم جمعها باستخدام نسخة معدلة من السيناريو سبايدر كما هو موضح في صفحة الويب http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.html . النصي يحفظ المداخن وجسيمات untilted إمالة كما u.spi وt.spi. يجب حفظ الأرقام من حيث صورة مجهرية من الجزيئات في particle_list.spi. (ملاحظة : هذا مهم جدا لتوليد زاوية يولر الصحيح للملفاتRCT).
القسم الفرعي 2 : ثنائي الأبعاد المحاذاة وتصنيف الصور untilted الجسيمات.
- تحويل الجزيئات في untilted IMAGIC - 5 تنسيق باستخدام برنامج em2em Imagic - 5 في الحزمة. محاذاة وتصنيفها إلى فئات الجزيئات متجانسة به تكرارا لبرامج IMAGIC - 5 (الملحق أ). باستخدام الأمر MSA - الأسماء في فئتها في IMAGIC - 5 لتوليد جدول بحث الطبقات من الجزيئات ، وهو ما حفظ ك imagic_classes.lis. (ملاحظة : يمكن تصنيف والمواءمة هو زيادة عدد الجسيمات مع نفس الشكل وكذلك تقليل التباين في فئة الفرق الخريطة من كل فئة توفير المعلومات حول نوعية الطبقة).
- إنشاء ملف المؤامرة (ali_50.plt في التظاهرة الفيديو) للقيم الترجمة وتناوب كل من الجسيمات محاذاة به الأمر في رأس IMAGIC - 5.
- تحويل الطبقات ننظر متابعة الجدول في وثيقة سبايدر الملفات SPI ***. base_file باستخدام lis2spi.pl المخطوطة وزعت في http://cryoem.berkeley.edu .
- تحويل القيم الترجمة وتناوب كل من الجسيمات المحاذاة من ملف المؤامرة ولدت لترجمة القيم والتناوب في الخطوة 5.6 في مستند سبايدر ali_50.spi ملف نصي باستخدام plt2spi.pl وزعت في http://cryoem.berkeley.edu .
نستخدم IMAGIC - 5 لمحاذاة 2D والتصنيف لأنه يعطي أفضل أداء على هذا المنصب في أيدينا. ويمكن الاطلاع على استراتيجية بديلة لسبايدر في محاذاة ثنائي الأبعاد وتصنيفها في http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html . وقد استخدمنا أيضا سبايدر لأداء تحليل 2D على جزيئات من untilted exosome. التالي هو إجراء بسيط.
بديل 5.5) استخدم المحاذاة مرجع خالية كما هو موضح في محاذاة الصور. يمكن العثور على اثنين من النصوص بسيطة حفظ التناوب والتحول من الجزيئات في كل وثيقة angular_file.spi الملف.
بديل 5.6) صنف الجزيئات الانحياز الى مجموعات مع وجهة النظر ذاتها كما هو موضح في وقد استخدمنا وسائل K - طريقة لتصنيفها. توليد base_file ***. SPI على أساس التصنيف.
القسم الفرعي 3 : ثلاثي الأبعاد إعادة الإعمار باستخدام الجسيمات الصور مائلة.
- الفرقة تمرير مرشح ، وقناع ومركز الجزيئات تماما كما يميل للجسيمات في untilted IMAGIC - 5. إنشاء مجموعة بيانات جديدة للجسيمات تحت عنوان. (ملاحظة : هذه الخطوة اختيارية ويمكن القيام به في سبايدر.)
- إنشاء ملفات الوثيقة anglular من الطبقات ننظر متابعة الجدول ali_50.spi الوثائق والملفات ***. DCB SPI التي تم إنشاؤها بواسطة شبكة الإنترنت في خطوة 5.3 وملف قائمة partile_list.spi الجسيمات من الخطوة 5.4 باستخدام البرنامج النصي سبايدر كما في الملحق باء
- استخدام البرامج النصية إعادة الإعمار في سبايدر للقيام إعادة الإعمار من كل فئة كما هو موضح في http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html . كل فئة من الجزيئات يساهم في مجلد واحد الإعمار 3D. يمكن فحص نماذج 3D في UCSF - 9 الوهم. ويمكن مقارنة إسقاط ثنائية الأبعاد 3D للنموذج في زاوية يولر (0،0،0) من متوسط الدرجة 2D المقابلة من الجزيئات untilted للتحقق من نوعية البناء. العثور على كميات مماثلة ، وضبط ودمجها لتوليد كميات الأولية التالية الإجراء http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html .
القسم الفرعي 4 : صقل وإعادة الإعمار 3D باستخدام الصور untilted الجسيمات.
- لا صقل الإسقاط مطابقة حجم الجسيمات الأولية المدمجة ضد جميع untilted للحصول على دقة أعلى volumه دون مخروط قطعة أثرية مفقودة وتسطيح باستخدام البرامج النصية كما هو موضح في سبايدر http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html .
6. ممثل النتائج :
باستخدام الأسلوب RCT ، لقد حصلنا على حوالي 50 من exosome اعادة البناء من إجمالي أزواج إمالة 5000 (الشكل 6). 50 من النماذج 3D ، يمكننا أن نرى توجهات مختلفة من الجلوس على الشبكة المعقدة مع الرأيين أساسا المتعامدة. ألف قطعة أثرية تسطيح كما كشف في العديد من وحدات التخزين في اتجاه عمودي على سطح الكربون. أجرينا المحاذاة ودمج وحدات التخزين 3D لتوليد مجلدين الأولية في وجهات النظر المتعامدة. باستخدام الصور 5000 الجسيمات untilted ، لقد حصلنا على نفس الإعمار 3D النهائي للقرار آنغستروم exosome في حوالي 18 من كل النماذج الأولية (الشكل 7). وكشف هيكل البنيان من exosome الخميرة وقدم رؤى على توظيف الحمض النووي الريبي مسار الركيزة 10.
الشكل 6 (50). 3D نماذج للمجمع عن طريق إعادة الإعمار exosome RCT.
الشكل 7. الإعمار 3D لمجمع exosome بعد الصقل.
التذييل :
التذييل ألف ملف نصي للمحاذاة 2D وتصنيفها في IMAGIC - 5.
ملف : auto_align_i.sh
انقر هنا للحصول على الملف
التذييل باء ملف نصي لتوليد ملف الزاوي لإعادة الإعمار في 3D سبايدر.
ملف : generate_angular_file.spi
انقر هنا للحصول على الملف
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا المقال نقدم بروتوكول مفصل لإعداد نموذج إعادة الإعمار وثلاثة الأبعاد للمجمع exosome السلبية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ. باستخدام هذه الطريقة ، حصلنا على اعادة اعمار 3D باستخدام طريقة عشوائية الميل المخروطية دون أي علم مسبق للهيكل. عشوائية طريقة الميل المخروطية لا يتطلب بالضرورة عينة متجانسة ولكن الخطوة التالية الإسقاط صقل مطابقة ستحتاج عينة متجانسة من أجل تحقيق دقة عالية.
لعينات الملون سلبيا ، سمك ملون من المهم جدا للأسلوب الميل المخروطية العشوائية في العمل. رقيقة جدا وصمة عار أسباب الهالة السوداء للجزيء في زاوية الميل العالية ، والتي تقدم التحف في إعادة الإعمار. سميكة جدا وصمة عار يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء من الجسيمات في صورة مجهرية. يمكن للشبكات holey الكربون التي تغطيها طبقة رقيقة من الكربون فيلم المستمر اننا نستخدم تساعد في تحقيق الظروف المثلى تلطيخ بسهولة أكبر. ويمكن استبدال محلية الصنع الكربون holey بواسطة شبكات holey المتاحة تجاريا مثل Quantifoil أو جيم مسطحة. نمط غير منتظم من الثقوب في المنازل المصنوعة holey الكربون ، ومع ذلك ، قد تساعد محاذاة micrographs يميل في كل تكبير المنخفضة والعالية.
في هذا البروتوكول ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لجزء المجهر الإلكتروني ، في محاذاة التي يجب أن نكون حذرين للغاية من أجل الحصول على المنطقة المقابلة للإمالة وmicrographs untilted ، والحصول على أكبر التداخل بين الميل وuntilt مجهرية. يمكن للطريقة العشوائية الميل المخروطية مساعدة في تحديد الإنصاف لا لبس فيه. خلال الممارسة ، ولكن ، على المرء أن يكون حذرا للغاية بشأن اتفاقية الفرق في إعدادات كاشف (CCD ، الفيلم الماسح الضوئي) ، صورة تحويل الشكل ، وحزم البرمجيات ، وإعدادات المعلمة النصي. الطريقة الأكثر موثوقية هو الحصول على إعادة بناء الهيكل المعروفة لإعداد اتفاقية الصحيح من الطغيان وتقرير لاستخدام بالضبط نفس الإجراءات ، واتفاقية لإعادة بناء أي أخرى.
في هذا البروتوكول ، وكنا مجموعة من مجموعات مختلفة ومعالجة الصور خلال اعادة الميل المخروطية عشوائي لأننا نريد الاستفادة من ميزات فريدة من نوعها في عبوات مختلفة. ولكن يمكن أن تتم جميع هذه الخطوات ضمن حزمة واحدة ، مثل سبايدر. Xmipp 11 هو عبارة عن حزمة وضعت مؤخرا مع المساعد التعمير RCT المضمنة فيه. كانت بعض وسائل التشغيل الآلي في مجال جمع البيانات ومعالجة الصور على حد سواء نفذت 12. قد بروتوكول لدينا خدمة الموصوفة هنا لمساعدة المبتدئين لفهم كامل عملية اعادة الاعمار الميل المخروطية عشوائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء نوغاليس مختبر في جامعة كاليفورنيا في بيركلي في المساعدة على إنشاء بروتوكولات الأولية وأعضاء وانغ مختبر في جامعة ييل في مساعدتهم لوضع بروتوكولات كاملة. نعترف أيضا من العاملين في البرد EM المرفق وعالية الأداء مركز الحاسوب في كلية ييل للطب لدعمهم. الأب هو رست سميث الأسرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Sciences | 63450-15-7 | |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | |
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4951F-001 | |
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | |
| Carbon coater Auto 306 | Edwards Lifesciences | ||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | ||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
