Summary
Denna artikel beskriver en standardiserad metod för att få en tredimensionell (3D) rekonstruktion av biologiska makromolekyler med hjälp av negativ mikroskopi färgning elektron (EM). I detta protokoll förklarar vi hur du får 3D-strukturen för Saccharomyces cerevisiae exosome komplex på medelhög upplösning med hjälp av slumpmässiga koniska metoden lutning rekonstruktion (RCT).
Abstract
Enda partikel elektronmikroskopi (EM) rekonstruktion har nyligen blivit ett populärt verktyg för att få den tredimensionella (3D) strukturen av stora makromolekylära komplex. Jämfört med röntgenkristallografi, har några unika fördelar. Först behöver enskild partikel EM rekonstruktion inte att kristallisera proteinet provet, som är flaskhalsen i röntgenkristallografi, särskilt för stora makromolekylära komplex. För det andra behöver det inte stora mängder protein prover. Jämfört med milligram av proteiner som behövs för kristallisering, behöver enskild partikel EM återuppbyggnaden bara några mikro-liter protein lösning på nanonivå molära koncentrationer, med hjälp av negativ färgning EM metod. Men trots ett par makromolekylära församlingar med hög symmetri, EM enda partikel är begränsat till relativt låg upplösning (mindre än 1 nm upplösning) i många exemplar, särskilt de utan symmetri. Denna teknik också begränsas av storleken på de molekyler som studeras, dvs 100 kDa för negativt färgade exemplar och 300 kDa för frysta hydrerad exemplar i allmänhet.
För ett nytt prov med okänd struktur, använder vi i allmänhet en tungmetall lösning för att bädda in molekyler av negativa färgning. Provet undersöks sedan i ett transmissionselektronmikroskop att ta två-dimensionella (2D) micrographs av molekylerna. Helst av proteinmolekyler har en homogen 3D-struktur men uppvisar olika inriktningar i micrographs. Dessa micrographs är digitaliserade och bearbetas i datorer som "enstaka partiklar". Med hjälp av två-dimensionell uppriktning och tekniker klassificering, är homogena molekyler i samma åsikter klustrade i klasser. Deras genomsnitt öka signalen av molekylen är 2D-former. Efter att vi tilldela partiklarna med rätt relativ orientering (Euler vinklar), kommer vi att kunna rekonstruera 2D-partikel bilder i en 3D virtuell volym.
I enstaka partikel 3D-rekonstruktion, är ett viktigt steg att korrekt tilldela rätt orientering för varje enskild partikel. Det finns flera metoder för att tilldela vyn för varje partikel, inklusive den kantiga beredning 1 och slumpmässiga koniska lutning (RCT) metod 2. I detta protokoll, beskriver vi vår verksamhet med att få 3D-rekonstruktion av jäst exosome komplexa med negativ färgning EM och RCT. Det bör noteras att vår protokollet för elektronmikroskopi och bildbehandling följer den grundläggande principen för RCT, men är inte det enda sättet att utföra metoden. Vi beskriver först hur att bädda in proteinet provet i ett lager av AUC-Formate med en tjocklek jämförbar med protein storlek, med hjälp av en Holey kol galler täckt med ett lager av tunt kol film. Sedan provet sätts in i ett transmissionselektronmikroskop att samla in icke vridna (0-grader) och lutande (55 grader) par micrographs som kommer att användas senare för bearbetning och få en första 3D-modell av jäst exosome. I detta syfte utför vi RCT och sedan förfina de ursprungliga 3D-modellen med hjälp av projektion matchande förfining metod 3.
Protocol
1. Principen om Random Konisk Tilt metod
- Principen om slumpmässig koniska luta metoden kräver att ett par av micrographs i samma region av prov inuti elektronmikroskop. En bild är tagen av provet i en icke vridna position (Figur 1A) och den andra bilden är tagen av provet lutar mellan 50 till 70 grader (i vårt fall använder vi 55 grader). (Figur 1B)
- Med hjälp av datorn, är den digitaliserade mikroskop paret satte sida vid sida och bilder från samma partiklar är markerade. (Figur 1C)
- I tredimensionella koordinater, är de bilder av icke vridna partiklar och deras lutar partner korrelerade till varandra genom riktningen för lutningen axeln och lutningsvinkel. (Figur 1D)
- Anpassningen av det icke vridna partikel bilderna ger bilder av lutas partiklar till deras motsvarande azimutala platser. (Figur 1E)
- Använda flera bilder av lutas partiklar fylla azimutala utrymme kan den tredimensionella strukturen av molekylen rekonstrueras med hjälp av en back-projektion algoritm. (Figur 1F)
Figur 1. En illustration av principen för RCT återuppbyggnad.
2. Förbered Galler för Holey Carbon täckt med tunna Carbon
Motivering: Vi använder negativ färgning metod för att fixa det protein prov för slumpmässiga koniska lutning återuppbyggnad. För att bevara de makromolekyler utan alltför mycket plattas under torkningen, försöker vi bädda in proteinmolekyler i en djup fläcken med en tjocklek på ungefär en dimension av proteiner 4. I allmänhet är kontinuerlig kol används för att göra negativt färgade exemplar. Sådan typ av kol är dock svårt att kontrollera fläcken tjocklek runt protein partiklar. Vi använder alltså hemmagjorda Holey kol nät täckta med ett tunt lager av kol film (~ 5 nm tjocklek) för att negativt färgade exemplar. Little brunnar som bildas av hålen kan behålla proteinet lösning och fläcken lösningen på nätet så det är mycket lättare att bädda in proteinet på ett optimalt fläck tjocklek. Dessutom minskar det tunna lagret av kol över hålet bakgrundsljudet kraftigt.
- Bered 0,5% Formvar lösning. I dragskåp, tillsätt 0,45 g polyvinylalkohol formella harts och 90 ml kloroform i en 100 ml glasbägare. Använd aluminiumfolie för att täcka bägaren, och använda en liten omrörare för att lösa upp formella harts på en magnetomrörare. Det tar ungefär 15 minuter att lösa upp hartset.
- Under upplösning av Formvar, rutschbanor ren mikroskopi glas i metanol och torka torrt med Kimwipes.
- Efter Formvar harts är helt upplöst i kloroform, tillsätt 1 ml 50% glycerol till ytan av lösningen. Justera volym läggas glycerol påverkar tätheten av hålen på Holey kol. Doppa spetsen av en ultrasonicator i lösningen vid ca 1 cm djup och använda maximal kraft för att Sonikera 1 min att göra emulsion av glycerol droppar i Formvar lösning. Den lösningen blir mjölkig efter detta steg. Längre sonication orsakar mindre storlek på hål på Holey kol.
- Omedelbart efter ultraljudsbehandling, doppa rengörs glaset glider vertikalt i emulsionen i 1 sekund, ta ut dem, och blot diabilder bottnarna med filterpapper för att bilda en tunn plastfilm över ytan av bilderna. Efter choloroform avdunstar, kontrollera täthet och storlek på hålen i filmen under ett ljusmikroskop. Justera beredningen skick efter behov. Med tillstånd som beskrivs här, får vi i allmänhet hål med diameter på 3 ~ 4 mikro-meter och 10 ~ 20 hål i varje ruta på ett 400 mesh grid.
- Efter att glaset bilderna är torra, klippa kanten av plastfilm på bilden ytan. Float filmen ut på ytan av destillerat vatten. Den tunna hinna på vattenytan kan observeras vid en blick vinkel mot ljuset reflektion. Placera 400-nät koppar nät på filmen en efter en, med galler "släta ytan nedåt.
- Plocka upp plastfilmen med galler på den med ett papper. Vänd papperet och låt den torka i en petriskål. Blötlägg pappret i metanol för att ta bort kvarvarande glycerol i hålen och låt papperet torka i luften.
- Coat näten med ett lager av kol med tjockleken på ~ 20 nanometer på en kol förångare. Tjockleken kan bestämmas genom att den grå färgen på kol.
- Blötlägg nät med kol i kloroform i en halvtimme för att ta bort Formvar. Efter att näten är torkade, har vi fått hemlagad Holey kol galler.
- Indunsta tunt lager av kol med ca 5 nanometer i tjocklek på färsk klyvs glimmer yta.
- Försiktigt satte Holey kol galler under destillerat vatten. Float den tunna kol från glimmer yta på vattenytan och sätta den på Holey kolgaller långsamt. Torka nät i dragskåp.
3. Negativ färgning av Exosome Complex
Motivering: Det finns en hel del tungmetaller fläcken lösningar som kan användas för negativ färgning EM, inklusive AUC acetat, AUC formiat, fosforvolframsyra, ammoniummolybdat och andra. Olika bets lösning har olika unika egenskaper. Till exempel ger AUC acetat hög kontrast i partikel, men kan krascha proteinkomplex som inte gillar sura miljö. För dessa prover kan phosphotungestic syra vid neutralt pH vara en bra fläck lösning. Vi väljer mättade AUC Formate (UF) lösning på grund av sin fina kornighet och hög inträngningsförmåga i molekyler.
- Koka vatten i 1 min. Kyl ner det långsamt till rumstemperatur. Detta steg är att ta bort löst syre från vattnet.
- Gör färska 2% AUC Formate (UF) lösning. Blanda 1 ml vatten och 20 mg UF i ett 1,5 ml rör. Vortexa i 10 min.
- Justera pH-värdet till 5,0 genom att tillsätta 2 mikroliter 10 M kaliumhydroxid. Blanda omedelbart. Lösningen Färgen bör vara mer gul. PH i lösningen inte bör vara för hög, annars fläcken utfällningar.
- Sätt röret på vortexer i ytterligare 10 min.
- Spin lösningen på ett skrivbord centrifugera vid maximal hastighet i 10 min.
- Filtrera lösningen genom ett 0,2 mikrometer PVDF membran. Detta är den färska UF lösningen. Täck lösningen röret i en bit aluminiumfolie för att förhindra ljus. Lösningen måste användas på samma dag.
- Glow urladdning en tunna kol-över-Holey kol rutnät med en glöd-utsläpp apparater i 30 sekunder vid 25 mA ström.
- Lägg en bit av ren parafilm på bänken. Sätt 3 droppar av 50 mikroliter UF fläck lösning ovanpå parafilm.
- Späd exosome komplex att en koncentration på 50 ~ 100 nm med en spädningsbuffert (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM DTT). Sätt 4 mikroliter av den utspädda protein på glöden ut-grid. Låt provet kvar på nätet i en minut. (Obs:. En sådan slutlig koncentration av molekyler som i allmänhet ger en optimal täthet av väl spridda partiklar på negativt färgade nätet för AUC formiat eller AUC acecate bets lösning är fosfat eller hög koncentration av salt (mer än 0,5 m) i allmänhet inte bra för få bra färgning resultat. Vår erfarenhet visar att Hepes eller rören fungerar bra med AUC fläcken lösningar.)
- Använd en bit filterpapper att utplåna den återstående lösningen från kanten av nätet och vänd nätet omedelbart ovanpå fläcken droppar och skölj nätet för ungefär 10 sekunder på varje droppe.
- Efter sista sköljningen, låt fläcken kvar på nätet för ytterligare 1 min och sedan blot fläcken bort med en bit filterpapper. Håll ett tunt lager av färg lösningen på nätet ytan för att få ett bra djup fläck resultat. Låt gallret torkar snabbt i dragskåp.
4. Elektronmikroskopi av Exosome Complex
Motivering: Alla transmissionselektronmikroskop med en lutande steg kan användas för att samla luta par av provet för RCT återuppbyggnad. I teorin kan den högre vinkel provet lutas samla in uppgifter, desto bättre. I praktiken, på grund av utformningen av provhållare och geometri nätet, är den maximala manövreras vinkel begränsas från 50 till 70 grader. I detta protokoll beskriver vi bara vår förfarande med en FEI Tecnai-12 elektronmikroskop. För övriga modeller av mikroskop, verksamheten måste anpassas till kravet på projektet och egendom instrumentet.
- Sätt provet nätet i provhållaren och sedan lägga in hållaren i ett FEI Tecnai -12 elektronmikroskop. Mikroskopet används vid 120 kV. Vi använder Gatan Ultrascan4000 CCD-kamera att ta bilder. Se till att "Vänd runt vertikala axeln" i "config kameran dialogrutan Digital mikroskop gränssnittet är markerad för att säkerställa korrekt handedness beslutsamhet. (Obs:. Detta är viktigt speciellt om läsaren är beroende av SPIDER RCT återuppbyggnaden förfaranden för att få en 3D-modell)
- Kontrollera provet rutnätet vid låg förstoring för att hitta den bästa färgade rutor. Sådan typ av rutor bör ha ett dussin hål med dimension ca 1 ~ 2 mikrometer och mörka fläcken områden i dem. (Figur 2)
Figur 2. En låg förstoring mikroskop av ett rutnät som visar torg med bra och dåliga fläckar. - Slå på låg dos läge FEI Användargränssnitt och anpassa sökningen fokus och utsätta position i låg dos-läge. Vi använder förstoringar på 150.000 för fokus, 52 tusen för exponering och 1,5 meter kamera längd i diffraktion för sökning. Exponeringstiden justeras till 1 sekund. Sätt fokus position 2 mikrometer bort från exponering POSition längs luta axeln.
- Hitta hålen med bra färgning i sökläge och spara platser. Den goda hål har generellt mörk fläck gradient i dem som observerats under sökläge. Ta en CCD bild av torget. Luta provet till 55 grader, ta en ny bild. Jämför de två bilderna, identifiera de parade hål i två micrographs. (Figur 3)
Figur 3. En lutning par micrographs av ett torg i sökläge. Motsvarande parade hål anges. - Luta steget tillbaka till 0 grader. Med hjälp av lågdos-kit för att ta bilder på varje hål som identifierats i sökläge vid hög förstoring. Den minskad fokus används är ca -0,7 mikrometer.
- När alla hål har tagit bilder av, luta scenen till 55 grader. Ta micrographs av lutas prov på samma förstoring som icke vridna dem med en minskad fokus på ca -1,2 mikrometer. Identifiera motsvarande lutas par micrographs bygger på mönster i låg förstoring micrographs. Den oregelbundet mönster av hemmagjorda Holey kol nät hjälper korrelation. Undersök lutning par micrographs och ta bort micrographs med dåliga fläckar som t.ex. grunda färgade områden (partiklar verkar ha en gloria runt dem under lutande tillstånd). (Figur 4)
Figur 4. Två lutning par micrographs av provet vid hög förstoring. Den goda och dåliga micrographs är markerade.
5. Bildbehandling av data
Motivering: Det finns olika alternativ och paket programvara för att utföra RCT återuppbyggnaden i datorn. Den mest allmänt används är SPIDER 5. En grundläggande protokoll för att utföra RCT i Spider finns i webbsidan http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html . Ett detaljerat protokoll för att utföra RCT i Spider beskrivs i artikeln av Shaikh et al. I vårt protokoll 6 använder vi en kombination av IMAGIC-5 7 och spindeln i videon versionen av protokollet. Vi erbjuder även ett alternativt förfarande för att enbart använda spindeln i texten versionen av protokollet.
- Setup programmen. Vi använder proc2d i asylnätverket 8 paketet för att ändra bildformat från Gatan digital bild till SPIDER bildformat. IMAGIC-5 används för att göra 2D-anpassningen. SPIDER används för att göra 3D-rekonstruktion och förfining.
Underavsnitt 1: Plocka luta par av partiklarna.
- Konvertera *. dm3 Gatan digital bild till SPIDER bildformat med proc2d kommandot i Emån. Den lutar och icke vridna par namnges i mönstret *** t.spi och *** u.spi, respektive.
- Välj partikeln paren med hjälp av "Web"-program distribueras i Spider programpaket. Följ instruktionen i Koordinaterna automatiskt sparas i DCU ***. SPI och DCT ***. spi för icke vridna och lutas partiklar respektive. Ett annat dokument DCB ***. SPI innehåller lutningsvinkel information mellan lutas och icke vridna partiklar (Anm:. De tre vinklar under montering i WEB mellan lutningen paren inte garantera korrekt handedness den slutliga återuppbyggnaden eftersom theta inte har tecken (positivt värde) och Phi och gamma lita på den ursprungliga värdena till dem. Undersöka riktning mot minskad fokus lutning på lutande mikroskop skulle hjälpa till att ställa rätt initiala värdena på phi och gamma innan montering för att få en korrekt handedness av återuppbyggnaden. Figur 5 illustrerar rätt konventionen.)
Figur 5. En illustration för att förklara konventionen av vinkeln beslutsamhet i WEB tilt-paret partikel plockar passande läge bestäms av minskad fokus gradient. H står för hög minskad fokus området medan L står för låg minskad fokus område. Pilen representerar lutande axel. Motsvarande rätt initiala vinklar för Phi och gamma anges för varje system. - Ruta ut alla plockade partiklar med hjälp av en modifierad version av SPIDER manus som visas på webbsidan http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.html . Script sparar icke vridna och lutas partikel staplar som u.spi och t.spi. Antalet mikroskop där partiklarna är från bör sparas i particle_list.spi. (OBS: Detta är mycket viktigt för att skapa den rätta Eulers vinkel filer förRCT.)
Underavsnitt 2: Två-dimensionell uppriktning och klassificering av det icke vridna partikel bilder.
- Konvertera icke vridna partiklar till IMAGIC-5-format med em2em program i Imagic-5 paket. Rikta in och klassificera partiklar i homogena klasser iterativt med IMAGIC-5 program (Bilaga A). Med hjälp av MSA-namnen i klassen kommandot i IMAGIC-5 för att generera klasser uppslagstabellen av partiklarna, som vi spara som imagic_classes.lis. (Notera:. Klassificeringen och anpassningen är att öka antalet partiklar med samma form samt minska variationen i en klass Varians karta över varje klass kan ge information om kvaliteten i klassen.)
- Generera en tomt fil (ali_50.plt i videon demonstration) för translation och rotation värden för anpassning av varje partikel med rubriken kommandot i IMAGIC-5.
- Konvertera klasserna look-up tabell i SPIDER dokumentfiler base_file ***. SPI hjälp av ett Perl-skript lis2spi.pl distribueras i http://cryoem.berkeley.edu .
- Konvertera translation och rotation värden för anpassning av varje partikel från tomten fil som genereras för översättning och värderingar rotation i steg 5,6 i SPIDER dokumentfil ali_50.spi använda ett skript plt2spi.pl distribueras i http://cryoem.berkeley.edu .
Vi använder IMAGIC-5 för 2D-anpassning och klassificering eftersom det ger den bästa prestandan på jobbet i våra händer. Alternativ strategi i Spider för de två-dimensionell uppriktning och klassificering finns på http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html . Vi har också använt SPIDER att utföra 2D-analys av icke vridna partiklar av exosome. Följande är en enkel procedur.
Alternativa 5,5) Använd referensen utan anpassning som beskrivs i anpassa bilderna. Två enkla skript hittas Spara rotation och förskjutning av alla partiklar i ett dokument fil angular_file.spi.
Alternativa 5,6) Klassificera linje partiklar i grupper med samma uppfattning som beskrivs i Vi har använt K-medel metod för klassificering. Generera base_file ***. SPI baserat på klassificering.
Underavsnitt 3: Tredimensionell rekonstruktion med lutande partikel bilder.
- Bandpassfilter, mask och centrera lutas partiklarna precis som för det icke vridna partiklar i IMAGIC-5. Skapa en ny uppsättning data för titeln partiklar. (Obs: Detta steg är valfritt Det kan göras i Spider..)
- Skapa anglular dokumentfiler från klasserna look-up table dokument ali_50.spi den DCB ***. spi-filer som genereras av webben i steg 5,3 och partikeln listfil partile_list.spi från steg 5,4 hjälp av SPIDER skriptet som i bilaga B.
- Använd rekonstruktion skript i SPIDER att göra återuppbyggnaden av varje klass som beskrivs i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html . Varje klass av partiklar som bidrar till en 3D-rekonstruktion volym. 3D-modellerna kan undersökas i UCSF-Chimera 9. En tvådimensionell projektion av 3D-modellen på Euler vinkel (0,0,0) kan jämföras med motsvarande 2D-klassen genomsnitt från det icke vridna partiklarna att kontrollera kvaliteten på återuppbyggnaden. Hitta liknande volymer, rikta och slå samman dem för att generera första volymerna i enlighet med förfarandet http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html .
Underavsnitt 4: Förädling av 3D-rekonstruktion med hjälp av icke vridna partikel bilder.
- Har projektion matchning förfining av det sammanslagna ursprungliga volymen mot alla icke vridna partiklar för att få en högre upplösning volume utan att missa kon och platta artefakt med hjälp av SPIDER skript som beskrivs i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html .
6. Representativa resultat:
Med hjälp av RCT-metoden har vi fått ca 50 rekonstruktioner av exosome av totalt 5000 lutning par (Figur 6). Från den 50 3D-modeller, kan vi se olika inriktningar av komplexet sitter på nätet med i huvudsak två ortogonala vyer. En plattas artefakt är också upptäckas i många av volymerna i den riktning vinkelrätt mot kol ytan. Vi utfört anpassning och sammanslagning av 3D-volymer för att generera två första volymerna i ortogonala projektioner. Använda 5000 icke vridna partikel bilder har vi fått samma slutliga 3D-rekonstruktion av exosome ca 18 Ångström upplösning från både grund-modeller (Figur 7). Strukturen visar arkitekturen i jästen exosome och gav insikter på RNA substrat rekrytering väg 10.
Figur 6. 50 3D-modeller av exosome komplex av RCT återuppbyggnad.
Figur 7. 3D rekonstruktion av exosome komplexa efter förfining.
Bilaga:
Bilaga A. skriptfil för 2D anpassning och klassificering i IMAGIC-5.
Fil: auto_align_i.sh
Klicka här för fil
Bilaga B. skriptfil för att generera kantiga filen för 3D-rekonstruktion i Spider.
Fil: generate_angular_file.spi
Klicka här för fil
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel presenterar vi ett detaljerat protokoll av provpreparering och tredimensionell rekonstruktion av exosome komplexa med negativ mikroskopi färgning elektron. Med denna metod fick vi 3D-rekonstruktion med slumpmässiga koniska luta metod utan några förkunskaper i strukturen. Slumpmässiga koniska luta metod kräver inte nödvändigtvis ett homogent prov men följande projektion matchande förfining steg skulle behöva en homogen prov för att uppnå hög upplösning.
För negativt färgade prover, är fläcken tjockleken mycket viktigt för slumpmässiga koniska luta metoden ska fungera. För tunn fläck orsakar svarta gloria av molekylen i hög vinkel, som introducerar artefakter i återuppbyggnaden. För tjock fläck minskar signal-brusförhållandet av partiklarna i mikroskop. Den Holey kol nät som omfattas av ett tunt lager av kontinuerlig kol film som vi använder kan hjälpa till att uppnå optimal färgning förhållandena lättare. Den hemgjorda Holey kol kan ersättas av kommersiellt tillgängliga Holey nät som Quantifoil eller C-plan. Den oregelbundet mönster av hål i hemmagjorda Holey kol kan dock hjälpa justera lutas micrographs i både låg och hög förstoring.
I detta protokoll bör särskild uppmärksamhet fästas vid elektronmikroskopi del, i vilken anpassning bör vara mycket försiktig för att få motsvarande område på lutas och icke vridna micrographs, och för att få det största överlappningen mellan tilt och untilt mikroskop. Den slumpmässiga koniska luta metod kan hjälpa bestämma handedness entydigt. Under praktiken har dock måste man vara mycket försiktig om konventionen skillnaden i inställningarna av detektorn (CCD, filmskanner), bildformat konvertering, programpaket och manus parameterinställningar. Det mest tillförlitliga sättet är att få en rekonstruktion av en känd struktur för att ställa in rätt konvention handedness beslutsamhet och att använda exakt samma förfarande och avtal för ytterligare rekonstruktioner.
I detta protokoll använde vi en kombination av olika paket bildbehandling vid slumpmässiga koniska luta rekonstruktion eftersom vi vill dra nytta av unika funktioner i olika paket. Men alla dessa steg kan ske inom ett paket som spindel. Xmipp 11 är ett nyligen utvecklat paket med en RCT rekonstruktion plugin inbäddat. Vissa automation metoder både för datainsamling och bildbehandling har genomförts 12. Vår protokoll som beskrivs här kan användas för att hjälpa nybörjare att förstå hela processen av slumpmässiga koniska lutning återuppbyggnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i Nogales lab på UC-Berkeley i hjälper till att etablera den första protokollen och medlemmar av Wang lab vid Yale University i deras hjälp för att upprätta fullständiga protokoll. Vi erkänner också den personal i Cryo-EM anläggning och högpresterande Beräkning Center vid Yale School of Medicine för deras stöd. HW är en Smith Family bidraget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Sciences | 63450-15-7 | |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | |
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4951F-001 | |
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | |
| Carbon coater Auto 306 | Edwards Lifesciences | ||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | ||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
