Summary
Dit artikel beschrijft een standaard methode om een drie-dimensionale (3D) reconstructie van biologische macromoleculen met behulp van negatieve kleuring van elektronenmicroscopie (EM) te krijgen. In dit protocol leggen we uit hoe u de 3D-structuur van de Saccharomyces cerevisiae exosome complex krijgen op medium resolutie met behulp van de random conische kantel reconstructie methode (RCT).
Abstract
Enkel deeltje elektronenmicroscopie (EM) reconstructie heeft onlangs uitgegroeid tot een populaire tool om de drie-dimensionale (3D) structuur van grote macromoleculaire complexen te krijgen. Vergeleken met X-ray kristallografie, heeft het een aantal unieke voordelen. Ten eerste, enkel deeltje EM reconstructie niet nodig om het eiwit monster, dat is het knelpunt in de X-ray kristallografie kristalliseren, vooral bij grote macromoleculaire complexen. Ten tweede is het niet nodig grote hoeveelheden eiwit monsters. Vergeleken met milligram van eiwitten die noodzakelijk zijn voor kristallisatie, enkel deeltje EM wederopbouw slechts enkele micro-liters van de eiwit-oplossing bij nano-molaire concentraties, het gebruik van de negatieve kleuring EM-methode. Ondanks een paar macromoleculaire assemblages met een hoge symmetrie, enkel deeltje EM is beperkt tot relatief lage resolutie (lager dan 1 nm resolutie) voor vele exemplaren in het bijzonder diegenen zonder symmetrie. Deze techniek wordt ook beperkt door de grootte van de moleculen onder studie, dat wil zeggen 100 kDa voor negatief gekleurde exemplaren en 300 kDa voor bevroren gehydrateerd exemplaren in het algemeen.
Voor een nieuwe steekproef van onbekende structuur, we meestal gebruik van een heavy metal oplossing om de moleculen insluiten door negatieve kleuring. Het monster wordt vervolgens onderzocht in een transmissie-elektronenmicroscoop om tweedimensionale (2D) microfoto van de moleculen te nemen. In het ideale geval de eiwitmoleculen hebben een homogene 3D-structuur, maar vertonen verschillende oriëntaties in de microfoto. Deze microfoto zijn gedigitaliseerd en verwerkt in computers als "single deeltjes". Met behulp van twee-dimensionale alignment en classificatie technieken, homogeen zijn moleculen in dezelfde standpunten geclusterd in klassen. Hun gemiddelde op verbetering van het signaal van 2D het molecuul vormen. Na wijzen we de deeltjes met de juiste relatieve oriëntatie (Euler hoeken), zullen we in staat zijn om de 2D-deeltje beelden te reconstrueren in een virtuele 3D-volume.
In single deeltje 3D-reconstructie, een essentiële stap is het correct toewijzen van de juiste oriëntatie van elk afzonderlijk deeltje. Er zijn verschillende methoden om de weergave van elk deeltje toe te wijzen, waaronder de hoekige reconstitutie 1 en willekeurige conische tilt (RCT) methode 2. In dit protocol beschrijven we onze praktijk in het krijgen van de 3D-reconstructie van gist exosome complex met behulp van negatieve kleuring EM en RCT. Opgemerkt moet worden dat ons protocol van elektronen microscopie en beeldverwerking het basisprincipe van RCT volgt, maar is niet de enige manier om de methode uit te voeren. We beschrijven eerst hoe het eiwit monster in te bedden in een laag van Uranyl-Formate met een dikte vergelijkbaar met de grootte van eiwit, met behulp van een essen carbon rooster bedekt met een laag van continue dunne koolstof film. Dan het monster wordt in een transmissie-elektronenmicroscoop te verzamelen Untilted (0 graden) en gekanteld (55 graden) paren van microfoto die later zullen worden gebruikt voor de verwerking en het verkrijgen van een eerste 3D-model van de gist exosome. Daartoe voeren we RCT en verfijnen van de eerste 3D-model met behulp van de projectie-matching verfijning methode 3.
Protocol
1. Principe van de Random conische Tilt Methode
- Het principe van de willekeurige conische kantel methode vereist het nemen van een paar van microfoto van hetzelfde gebied van het specimen in de elektronenmicroscoop. Een foto is gemaakt van het model in een Untilted positie (Figuur 1A) en de andere foto is genomen van het model gekanteld in een hoek tussen de 50 tot 70 graden (in ons geval gebruiken we 55 graden). (Figuur 1B)
- Met behulp van de computer, de gedigitaliseerde microfoto paar wordt gelegd naast elkaar en beelden uit dezelfde deeltjes zijn geselecteerd. (Figuur 1C)
- In drie-dimensionale coördinaten, zijn de beelden van Untilted deeltjes en hun partners gekanteld gecorreleerd aan elkaar door de richting van de kantel-as en de hellingshoek. (Figuur 1D)
- De uitlijning van de Untilted deeltje beelden brengt de beelden van de gekantelde deeltjes hun overeenkomstige azimuthale locaties. (Figuur 1E)
- Het gebruik van meerdere afbeeldingen van gekanteld deeltjes het vullen van de azimutale ruimte, kunnen de drie-dimensionale structuur van het molecuul worden gereconstrueerd met behulp van een back-projectie algoritme. (Figuur 1F)
Figuur 1. Een illustratie van het principe van RCT wederopbouw.
2. Bereid de Rasters van Holey Carbon bedekt met een dunne Carbon
Achtergrond: We maken gebruik van negatieve kleuring methode om de eiwitmonster oplossing voor willekeurige conische tilt wederopbouw. Met het oog op de macromoleculen te behouden zonder al te veel vlakken tijdens het drogen, we proberen om de eiwitmoleculen in te bedden in een diepe vlek met een dikte van ongeveer de afmeting van eiwitten 4. In het algemeen is continu carbon gebruikt bij het maken van negatief gekleurde exemplaren. Een dergelijke vorm van koolstof, is echter moeilijk om de vlek dikte rond de eiwitdeeltjes te controleren. We dus gebruik van home-made essen carbon roosters bedekt met een dunne laag van koolstof film (~ 5 nm dikte) negatief gekleurde exemplaren te maken. Kleine putten gevormd door de gaatjes kan behoud van de eiwit-oplossing en de vlek oplossing op de rooster, zodat het veel gemakkelijker is om eiwitten te verankeren in een optimale vlek dikte. Bovendien is de dunne laag van koolstof over het gat vermindert het achtergrondgeluid sterk.
- Bereid 0,5% formvar oplossing. In de zuurkast, voeg 0,45 g polyvinyl formele hars en 90 ml chloroform in een 100 mL bekerglas. Gebruik aluminiumfolie om de beker te dekken, en gebruik een klein roer bar te helpen oplossen formele hars op een magneetroerder. Het duurt ongeveer 15 minuten om ontbinding van de hars.
- Tijdens de ontbinding van de formvar, schone microscopie glas schuift in methanol en wrijf droog met Kimwipes.
- Nadat de formvar hars volledig is opgelost in chloroform, voeg 1 ml 50% glycerol aan het oppervlak van de oplossing. Het volume van de toegevoegde glycerol invloed op de dichtheid van de gaten in de vol gaten koolstof. Dip de punt van een ultrasonicator in de oplossing bij ongeveer 1 cm diep en gebruik de maximale kracht om 1 min ultrasone trillingen ten einde emulsie van glycerol druppels in formvar oplossing te maken. De oplossing wordt melkachtige na deze stap. Langere sonicatie oorzaken kleinere omvang van gaten in de vol gaten koolstof.
- Direct na de sonicatie, verticaal Dompel de gereinigde glazen dia's in de emulsie voor een seconde, schakel ze uit, en dep de dia's 'bottoms met filtreerpapier om een dunne plastic film te vormen over het oppervlak van de dia's. Na de choloroform verdampt, controleer de dichtheid en de grootte van de gaten in de film onder een lichtmicroscoop. Pas de voorbereiding voorwaarde volgens de behoeften. Met de voorwaarde die hier beschreven, we in het algemeen krijgen gaatjes met een diameter van 3 ~ 4 micro-meter en 10 ~ 20 gaten in elk vierkant van een 400 mesh grid.
- Nadat de glazen plaatjes zijn droog, snijd de rand van het plastic folie op de dia oppervlak. Drijven de film af op de oppervlakte van gedestilleerd water. De dunne film op het water oppervlak kan worden waargenomen bij een blik schuin tegen het licht reflectie. Plaats 400-mesh koperen roosters op de film een voor een, met de roosters 'gladde oppervlak naar beneden.
- Pak de plastic film met roosters op met behulp van een stuk papier. Flip het papier en laat het drogen in een petrischaal. Geniet van het papier in methanol om de resterende glycerol in de gaten te verwijderen en het papier droog in de lucht te laten.
- De vacht van de roosters met een laag van koolstof met de dikte van ~ 20 nanometer in een carbon verdamper. De dikte kan worden bepaald door de grijze kleur van de koolstof.
- Week de roosters met koolstof in chloroform een half uur om de formvar te verwijderen. Nadat de roosters zijn gedroogd, hebben wij home-made essen carbon netten.
- Damp dunne laag van koolstof met ongeveer vijf nanometer dik op vers geknipte mica oppervlak.
- Voorzichtig zet het vol gaten carbon roosters onder gedestilleerd water. Drijven de dunne koolstof uit de mica oppervlak op het water oppervlak en storten het op de vol gaten koolstofgrids langzaam. Droog de roosters in een zuurkast.
3. Negatieve kleuring van het Exosome Complex
Achtergrond: Er zijn nogal wat zware metalen vlek oplossingen die kunnen worden gebruikt voor negatieve kleuring EM, waaronder uranylacetaat, uranyl formiaat, fosfowolfraamzuur, ammoniummolybdaat, en anderen. Verschillende vlek oplossing heeft verschillende unieke eigenschappen. Bijvoorbeeld, uranylacetaat biedt een hoge contrast van het deeltje, maar kan crashen eiwit complexen die niet als zure omgeving. Voor deze monsters kan phosphotungestic zuur bij neutrale pH een goede vlek oplossing. We kiezen verzadigde Uranyl Formate (UF) oplossing vanwege zijn fijne granulariteit en de hoge penetratie mogelijkheden in moleculen.
- Kook gedestilleerd water gedurende 1 minuut. Afkoelen langzaam tot kamertemperatuur. Deze stap is het verwijderen van opgeloste zuurstof uit het water.
- Het maken van verse 2% Uranyl Formate (UF) oplossing. Meng 1 ml water en 20 mg UF in een 1.5 ml buis. Vortex gedurende 10 minuten.
- Pas de pH-waarde op 5,0 door toevoeging van 2 microliter van 10 M kaliumhydroxide. Mix onmiddellijk. De oplossing kleur moet meer geel. De pH van de oplossing moet niet te hoog, anders wordt de vlek precipitaten.
- Zet de buis op vortexer voor nog eens 10 minuten.
- Spin de oplossing op een desktop centrifuge op maximale snelheid gedurende 10 minuten.
- Filtreer de oplossing door een 0,2 micrometer PVDF membraan. Dit is de verse UF oplossing. Bedek de oplossing buis in een stuk aluminiumfolie aan het licht te voorkomen. De oplossing moet worden gebruikt op dezelfde dag.
- Glimontlading een thin-koolstof-over-essen carbon rooster met behulp van een glow-ontlading apparaat gedurende 30 seconden bij 25 mA stroom.
- Leg een stukje schoon parafilm op de bank. Doe 3 druppels van 50 microliter UF vlek oplossing op de top van de Parafilm.
- Verdun de exosome complex tot een concentratie van 50 ~ 100 nm, waarbij de verdunning buffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM DTT). Leg 4 microliter van het verdunde eiwit op de gloed-ontladen grid. Laat het monster verblijf op de grid voor een minuut. (Let op:. Dergelijk een uiteindelijke concentratie van moleculen over het algemeen geeft een optimale dichtheid van goed verspreide deeltjes op de negatief gekleurde raster Voor uranyl formate of uranyl acecate vlek oplossing, de fosfaat of hoge concentratie van zout (meer dan 0,5 M) in het algemeen is niet goed voor het krijgen van goede kleuringen. Onze ervaring suggereert dat Hepes of Pipes goed werken met de uranyl vlek oplossingen.)
- Gebruik een stukje filtreerpapier aan de resterende oplossing vlek vanaf de rand van het rooster en onmiddellijk flip het net op de top van de vlek druppels en spoel het net gedurende ongeveer 10 seconden op elke druppel.
- Na de laatste spoeling, laat de vlek blijven op de grid voor een ander een min en daarna dep de vlek weg met een stukje filtreerpapier. Houd een dun laagje van de vlek oplossing op de grid oppervlak om een goede diepe vlek resultaten te krijgen. Laat het rooster snel drogen in een zuurkast.
4. Elektronenmicroscopie van de Exosome Complex
Achtergrond: Elke transmissie-elektronenmicroscoop met een kantelbare stadium kan worden gebruikt om kantelen paren van het monster voor de RCT reconstructie te verzamelen. In theorie kan de hogere hoek het monster worden gekanteld om gegevens, des te beter te verzamelen. In de praktijk is te wijten aan het ontwerp van de preparaathouder en de geometrie van het rooster, is de maximale hoek te bedienen beperkt 50 tot 70 graden. In dit protocol beschrijven we alleen onze procedure met behulp van een FEI Tecnai-12 elektronenmicroscoop. Voor de andere modellen van microscopen, de activiteiten moeten worden aangepast volgens de behoefte van het project en eigendom van het instrument.
- Zet het monster raster in de monsterhouder en vervolgens de houder gezet in een FEI Tecnai -12 elektronenmicroscoop. De microscoop wordt bediend op 120 kV. We maken gebruik van Gatan Ultrascan4000 CCD-camera om foto's te maken. Zorg ervoor dat de 'Flip rond verticale as' in het dialoogvenster 'config camera' van Digital microfoto interface is aangevinkt op de juiste willekeur bepaling te verkrijgen. (Let op:. Dit is belangrijk, vooral als de lezer is gebaseerd op SPIDER RCT wederopbouw van procedures om een 3D-model)
- Controleer het monster net bij een lage vergroting om de beste gekleurde vierkantjes te vinden. Een dergelijke vorm van vierkantjes moet een dozijn van gaten met een afmeting van ongeveer 1 ~ 2 micrometer en donkere vlek gebieden in hen. (Figuur 2)
Figuur 2. Een lage vergroting microfoto van een rooster te zien pleinen met goede en slechte vlekken. - Zet de lage dosis modus van de FEI gebruikersinterface en richt het zoeken, focus en bloot positie in lage dosis mode. We maken gebruik van vergrotingen van 150.000 voor de focus, belichting en 52.000 voor de 1.5 meter lengte in de camera diffractie voor zoeken. De belichtingstijd wordt aangepast aan 1 seconde. Stel de focus positie 2 micrometer afstand van de blootstelling position langs de kantelen as.
- Vind de gaten met goede kleuren, op zoek naar mode, en sla de locaties. De goede gaten hebben over het algemeen donkere vlek gradiënt in hen waargenomen onder de zoekmodus. Maak een CCD beeld van het plein. Kantel het monster tot 55 graden, neem een ander beeld. Vergelijk de twee foto's, identificeren van de gepaarde gaten in de twee microfoto. (Figuur 3)
Figuur 3. Tilt een paar van microfoto van een plein in zoekmodus. Overeenkomstige gepaarde gaten worden aangegeven. - Kantel het podium terug naar 0 graden. Met behulp van de lage dosis kit om foto's van elke hole die in de zoekmodus bij een hoge vergrotingsfactor te nemen. De gebruikte onscherp is ongeveer -0,7 micrometer.
- Nadat alle gaten zijn genomen foto's van, kantel het podium tot 55 graden. Neem microfoto van de gekantelde monster op dezelfde vergroting als Untilted degenen met een defocus van ongeveer -1,2 micrometer. Welke de overeenkomstige gekanteld paren van microfoto op basis van de patronen in de lage vergroting microfoto. Het onregelmatige patroon van de home-made essen carbon grids helpt de correlatie. Onderzoek tilt paren van microfoto en verwijder de microfoto met slechte vlekken zoals ondiepe gekleurde gebieden (deeltjes lijken een aureool om hen heen hebben onder voorwaarde gekanteld). (Figuur 4)
Figuur 4. Tilt Twee paren van microfoto van het monster bij een hoge vergrotingsfactor. De goede en slechte microfoto zijn gemarkeerd.
5. Afbeelding verwerking van de gegevens
Achtergrond: Er zijn verschillende opties en softwarepakketten op de RCT wederopbouw in de computer uit te voeren. De meest gehanteerde is SPIDER 5. Een basis protocol om RCT uit te voeren in Spider is te vinden in de webpagina http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html . Een gedetailleerd protocol om RCT uit te voeren in Spider is beschreven in het artikel door Shaikh et al.. 6 In ons protocol, gebruiken we een combinatie van Imagic-5 7 en SPIDER in de video versie van het protocol. We bieden ook een alternatieve procedure uitsluitend SPIDER te gebruiken in de tekst versie van het protocol.
- Het instellen van de programma's. We gebruiken de proc2d in de EMAN 8 pakket om het beeldformaat veranderen van Gatan Digitale afbeelding om SPIDER beeldformaat. Imagic-5 wordt gebruikt om de 2D-alignment te doen. SPIDER wordt gebruikt om de 3D reconstructie en verfijning te doen.
Onderafdeling 1: Picking tilt paren van de deeltjes.
- Zet de *. dm3 Gatan Digitale afbeelding om SPIDER image formaat met behulp van de proc2d commando in EMAN. De gekanteld en Untilted paren zijn genoemd in patroon als *** t.spi en *** u.spi, respectievelijk.
- Kies het deeltje paren met 'Web' programma verspreid in SPIDER-programma pakket. Volg de instructies in de Coördinaten worden automatisch opgeslagen in DCU ***. spi en DCT ***. spi voor Untilted en gekanteld deeltjes respectievelijk. Een ander document dcb ***. spi bevat de hellingshoek informatie tussen gekanteld en Untilted deeltjes (. Opmerking: De drie hoeken tijdens de montage in WEB tussen de paren tilt niet in voor de juiste handigheid van de uiteindelijke reconstructie, omdat theta heeft niet de teken (positieve waarde) en phi en gamma vertrouwen op de oorspronkelijke waarden te stellen aan hen. Onderzoek de richting van de defocus gradiënt op de gekantelde microfoto zou helpen bij het opzetten van de juiste beginwaarden van de phi en gamma vóór het aanbrengen, om een correct te krijgen handigheid van de reconstructie. Figuur 5 illustreert de juiste conventie.)
Figuur 5. Een illustratie aan de conventie van hoek vastberadenheid verklaren in WEB tilt-pair deeltje picking fitting mode bepaald door de defocus verloop. H staat voor high-defocus gebied terwijl L staat voor low-defocus gebied. De pijl geeft aan kantelbare as. De bijbehorende juiste initiële hoeken voor PHI en GAMMA zijn geïndiceerd voor elke regeling. - Box alles uit de uitgekozen deeltjes met behulp van een aangepaste versie van de SPIDER script, zoals aangegeven in de webpagina http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.html . Script slaat de Untilted en gekanteld deeltje stacks als u.spi en t.spi. De nummers van microfoto waar de deeltjes zijn afkomstig uit moet worden opgeslagen in particle_list.spi. (Opmerking: Dit is zeer belangrijk voor het genereren van de juiste Euler hoek-bestanden voorRCT).
Onderafdeling 2: Twee-dimensionale uitlijning en de indeling van de Untilted deeltje beelden.
- Zet de Untilted deeltjes in Imagic-5 formaat met behulp van em2em programma in Imagic-5 pakket. Lijn en classificeren van de deeltjes in homogene klassen iteratief met behulp van de Imagic-5 programma's (bijlage A). Met behulp van de MSA-namen-in-class commando in Imagic-5 voor het genereren van lessen opzoektabel van de deeltjes, die we opslaan als imagic_classes.lis. (Opmerking:. De indeling en afstemming is om het aantal deeltjes toeneemt met dezelfde vorm als de variatie in een klas reduce Variantie kaart van elke klasse kan informatie verschaffen over de kwaliteit van de klas.)
- Genereer een plot-bestand (ali_50.plt in de video demonstratie) voor de omzetting en-rotatie waarden van de aanpassing van elk deeltje met behulp van header commando in Imagic-5.
- Zet de klassen look-up tabel in SPIDER documentbestanden base_file ***. spi met behulp van een perl script lis2spi.pl verspreid in http://cryoem.berkeley.edu .
- Zet de vertaling en rotatie waarden van de aanpassing van elk deeltje van het perceel bestand gegenereerd voor vertaling en rotatie waarden in stap 5.6 in SPIDER documentbestand ali_50.spi met behulp van een script plt2spi.pl verspreid in http://cryoem.berkeley.edu .
We maken gebruik van Imagic-5 voor de 2D-alignment en de classificatie, want het geeft de beste prestaties op dit werk in onze handen. Alternatieve strategie in Spider voor de twee-dimensionale uitlijning en de indeling is te vinden op http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html . We hebben ook gebruik gemaakt SPIDER om de 2D-analyse van de Untilted deeltjes van het exosome uit te voeren. Hieronder volgt een eenvoudige procedure.
Alternatief 5.5) Gebruik de referentie-free alignment, zoals beschreven in de uitlijnen van de afbeeldingen. Twee eenvoudige scripts kunnen worden gevonden Sla de rotatie en verschuiving van alle deeltjes in een document bestand angular_file.spi.
Alternatief 5.6) classificeren de lijn deeltjes in groepen met dezelfde mening toegedaan, zoals beschreven in We hebben gebruikt K-verstaan de methode voor de classificatie. Genereer base_file ***. spi op basis van de classificatie.
Sub-sectie 3: Drie-dimensionale reconstructie met behulp van de gekantelde deeltje beelden.
- Band-pass filter, masker en het centrum van de gekantelde deeltjes net als voor de Untilted deeltjes in Imagic-5. Het genereren van een nieuwe dataset voor de titel deeltjes. (Opmerking: Deze stap is optioneel Het kan worden gedaan in SPIDER..)
- Maak anglular documentbestanden uit de klassen look-up tabel worden ali_50.spi, de DCB ***. spi-bestanden gegenereerd door web in stap 5.3 en het deeltje lijst bestand partile_list.spi uit stap 5.4 het gebruik van de SPIDER script zoals in Appendix B.
- Gebruik reconstructie scripts in SPIDER om de wederopbouw van elke klasse te doen, zoals beschreven in http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html . Elke klasse van deeltjes draagt bij aan een 3D-reconstructie volume. De 3D modellen kunnen worden onderzocht in UCSF-Chimera 9. Een twee-dimensionale projectie van het 3D-model bij Euler hoek (0,0,0) kan worden vergeleken met de overeenkomstige 2D-klasse gemiddelde van de Untilted deeltjes om de kwaliteit van de reconstructie te verifiëren. Zoek vergelijkbare volumes, het richten en samenvoegen om de eerste volumes volgens de procedure te genereren http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html .
Sub-sectie 4: Verfijning van de 3D-reconstructie met behulp van Untilted deeltje beelden.
- Doe projectie matching verfijning van de gefuseerde aanvankelijke volume tegen alle Untilted deeltjes om een hogere resolutie te krijgen volume zonder ontbrekende kegel en afvlakking artefact gebruiken SPIDER scripts, zoals beschreven in http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html .
6. Representatieve resultaten:
Met behulp van de RCT methode, hebben wij ongeveer 50 reconstructies van de exosome uit een totaal van 5.000 tilt paren (figuur 6). Van de 50 3D-modellen, zien we verschillende oriëntaties van het complex zitten op de grid met vooral twee orthogonale uitzicht. Een afvlakking artefact is ook waarneembaar in veel van de volumes in de richting loodrecht op de koolstof oppervlak. We voerden afstemming en samenvoeging van de 3D-volumes die de eerste twee volumes bij orthogonale uitzicht te genereren. Met behulp van de 5000 Untilted deeltje beelden, hebben wij hetzelfde uiteindelijke 3D-reconstructie van de exosome op ongeveer 18 Angstrom resolutie van zowel de eerste modellen (figuur 7). De structuur blijkt de architectuur van de gist exosome en op voorwaarde dat inzichten op het RNA-substraat werving pad 10.
Figuur 6. 50 3D-modellen van de exosome complex door RCT wederopbouw.
Figuur 7. 3D reconstructie van de exosome complex na verfijning.
Bijlage:
Bijlage A. Het script bestand voor 2D-alignment en de indeling in Imagic-5.
File: auto_align_i.sh
Klik hier voor de file
Bijlage B. Het script bestand voor het genereren van hoekig-bestand voor 3D reconstructie in SPIDER.
File: generate_angular_file.spi
Klik hier voor de file
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol van monstervoorbereiding en driedimensionale reconstructie van de exosome complex met behulp van negatieve kleuring elektronenmicroscopie. Met behulp van deze methode, kregen we de 3D-reconstructie met behulp van willekeurige conische kantel methode zonder enige voorkennis van de structuur. Random conische tilt methode vereist niet noodzakelijk een homogeen monster, maar de volgende projectie matching verfijning stap zou een homogeen monster nodig hebben om een hoge resolutie te bereiken.
Voor negatief gekleurde monsters, de vlek dikte is zeer belangrijk voor de willekeurige conische kantel methode om te werken. Te dun vlek zorgt ervoor dat de zwarte halo van het molecuul in hoge hellingshoek, die artefacten introduceert in de wederopbouw. Te dikke vlek vermindert de signaal-ruis verhouding van de deeltjes in de microfoto. De essen carbon roosters bedekt met een dunne laag van koolstof continue film die wij gebruiken kan helpen bij het bereiken van optimale condities vlekken gemakkelijker. De home-made essen koolstof kan worden vervangen door commercieel verkrijgbare essen roosters zoals Quantifoil of C-flat. Het onregelmatige patroon van de gaten in de zelfgemaakte essen carbon, echter, kan helpen de lijn gekanteld microfoto in zowel lage als hoge vergrotingen.
In dit protocol, moet speciale aandacht worden besteed aan de elektronenmicroscopie deel, waarin de afstemming moeten heel voorzichtig zijn om het overeenkomstige gebied van de gekanteld en Untilted microfoto te krijgen, en de grootste overlap tussen de kantel-en untilt microfoto te krijgen. De willekeurige conische kantel methode kan helpen ondubbelzinnig vast te stellen van de willekeur. Tijdens de praktijk echter, moet men zeer voorzichtig over de conventie verschil in instellingen van de detector (CCD-, film-scanner), image formaat conversie, softwarepakketten, en het script parameter instellingen. De meest betrouwbare manier is om een reconstructie van een bekende structuur te krijgen om het opzetten van de juiste conventie van de willekeur vastberadenheid en om precies dezelfde procedure en conventie te gebruiken voor verdere reconstructies.
In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van een combinatie van verschillende beeldverwerking pakketten tijdens de willekeurige conische tilt reconstructie, omdat we willen profiteren van de unieke functies in verschillende pakketten. Maar al deze stappen kan worden gedaan binnen een pakket, zoals SPIDER. Xmipp 11 is een recent ontwikkelde pakket met een RCT reconstructie plugin die geïntegreerd is in het. Sommige automatisering methoden in zowel het verzamelen van gegevens en beeldverwerking zijn geïmplementeerd 12. Ons protocol hier beschreven, kan dienen om beginners te helpen het hele proces van de random conische tilt reconstructie te begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de leden van Nogales lab bedanken UC Berkeley-in het helpen van vaststelling van de eerste protocollen en de leden van Wang lab aan de Yale University in hun hulp om de volledige protocollen vast te stellen. We erkennen ook dat het personeel in de cryo-EM-faciliteit en High-Performance Computation Center aan de Yale School of Medicine voor hun steun. HW is een Smith Family opdrachtnemer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Sciences | 63450-15-7 | |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | |
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 4951F-001 | |
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | |
| Carbon coater Auto 306 | Edwards Lifesciences | ||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | ||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
