Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical
Summary
Este artigo descreve um método padrão para obter uma reconstrução tridimensional (3D) de macromoléculas biológicas por microscopia eletrônica de coloração negativa (EM). Neste protocolo, vamos explicar como obter a estrutura 3D do complexo exossomo Saccharomyces cerevisiae em média resolução usando o método de reconstrução cônica aleatória de inclinação (RCT).
Abstract
Microscopia eletrônica única partícula (EM) de reconstrução recentemente se tornou uma ferramenta popular para obter a estrutura tridimensional (3D) de complexos macromoleculares grandes. Comparado a cristalografia de raios X, ele tem algumas vantagens exclusivas. Primeiro, única partícula EM reconstrução não precisa cristalizar a amostra de proteína, que é o gargalo em cristalografia de raios X, especialmente para grandes complexos macromoleculares. Em segundo lugar, ele não precisa de grandes quantidades de amostras de proteínas. Em comparação com miligramas de proteínas necessárias para a cristalização, única partícula de reconstrução EM só precisa de vários micro-litros de solução de proteína em concentrações nano-molar, utilizando o método de coloração negativa EM. No entanto, apesar de uma assembleias macromolecular poucos com simetria de alta, única partícula EM é limitada a uma resolução relativamente baixa (inferior a 1 nm Resolução) para muitos espécimes especialmente aqueles sem simetria. Esta técnica também é limitada pelo tamanho das moléculas em estudo, ou seja, 100 kDa para os espécimes negativamente coradas e 300 kDa para congelados hidratado espécimes em geral.
Para uma nova amostra de estrutura desconhecida, geralmente usamos uma solução de metais pesados para incorporar as moléculas através da coloração negativa. A amostra é então examinado em um microscópio eletrônico de transmissão de tomar duas dimensões (2D) micrografias das moléculas. Idealmente, as moléculas de proteína têm uma estrutura homogênea 3D, mas apresentam diferentes orientações na micrografias. Essas micrografias são digitalizadas e processadas em computadores como "partículas single". Usando dois-dimensional de alinhamento e técnicas de classificação, as moléculas homogêneas no mesmos pontos de vista são agrupados em classes. Suas médias melhorar o sinal de formas 2D da molécula. Depois vamos atribuir as partículas com a orientação adequada relativa (ângulos de Euler), seremos capazes de reconstruir as imagens das partículas 2D em um volume 3D virtual.
Na única partícula de reconstrução 3D, é um passo essencial para atribuir corretamente a orientação adequada de cada partícula. Existem vários métodos para atribuir o ponto de vista de cada partícula, incluindo a reconstituição angular 1 e aleatória cônica tilt método (RCT) 2. Neste protocolo, descrevemos nossa prática no sentido de obter a reconstrução 3D do complexo levedura exossomo usando coloração negativa EM e RCT. Deve-se notar que o nosso protocolo de microscopia eletrônica e processamento de imagem segue o princípio básico da RCT, mas não é a única maneira de executar o método. Primeiro, descrevem como incorporar a amostra de proteína em uma camada de uranilo Formate com uma espessura comparável ao tamanho da proteína, utilizando uma grade de carbono holey coberto com uma camada de película de carbono contínua fina. Em seguida, a amostra é inserida em um microscópio eletrônico de transmissão de recolher untilted (0 graus) e inclinada (55 graus) pares de micrografias, que será usado posteriormente para o processamento e obtenção de um modelo inicial em 3D do exossomo levedura. Para este fim, realizamos RCT e refinar o modelo inicial em 3D usando o método de projeção combinando refinamento 3.
Protocol
Discussion
Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado de preparação de amostras e reconstrução tridimensional do complexo exossomo meio de microscopia eletrônica negativa coloração. Usando este método, obtivemos a reconstrução em 3D usando o método aleatório inclinação cônica sem qualquer conhecimento prévio da estrutura. Método aleatório inclinação cônica não exige necessariamente uma amostra homogênea, mas o seguinte projeção passo de refinamento de correspondência seria necessário uma amostra ho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer aos membros de Nogales laboratório na Universidade da Califórnia-Berkeley em ajudar a estabelecer os protocolos iniciais e os membros do Wang laboratório na Universidade de Yale em sua ajuda para estabelecer os protocolos completa. Reconhecemos também as equipes em crio-EM facilidade e alto desempenho Centro de Computação na Universidade de Yale School of Medicine, pelo seu apoio. HW é um Smith Família premiado.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Polyvinyl Formal Resin | Electron Microscopy Science | 63450-15-7 | ||
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Science | 22451 | ||
| Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientist | 4951F-001 | ||
| 400 mesh grid regular | SPI Supplies | 3040C | ||
| Carbon coater Auto 306 | Edwards | |||
| Tecnai-12 Electron Microscope | FEI | |||
| Glow Discharger | BAL-TEC | Sputter Coater SCD 005 |
References
- van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
- Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
- Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification – powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
- Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
- Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera–a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
- Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3′ end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
- Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
- Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).
