Electron Microscopy sola partícula Reconstrucción del Complejo exosoma utilizando el método aleatorio inclinación cónica

Summary

En este artículo se describe un método estándar para obtener una imagen tridimensional (3D) de la reconstrucción de macromoléculas biológicas mediante microscopía electrónica de tinción negativa (EM). En este protocolo, se explica cómo conseguir la estructura 3D del complejo exosoma Saccharomyces cerevisiae con una resolución media, sirviéndose del método al azar cónica reconstrucción de inclinación (ECA).

Abstract

Microscopía electrónica de una sola partícula (EM) de reconstrucción se ha convertido recientemente en una herramienta popular para conseguir las tres dimensiones (3D), estructura de grandes complejos macromoleculares. En comparación con cristalografía de rayos X, que tiene algunas ventajas únicas. En primer lugar, una sola partícula de EM reconstrucción no es necesario para cristalizar la muestra de proteína, que es el cuello de botella en la cristalografía de rayos X, especialmente para los grandes complejos macromoleculares. En segundo lugar, que no necesita grandes cantidades de muestras de proteínas. En comparación con los miligramos de proteínas necesarias para la cristalización, una sola partícula de reconstrucción EM sólo necesita varios micro-litros de solución de proteína en nano-molar concentraciones, utilizando el método de tinción negativa EM. Sin embargo, a pesar de algunas asambleas macromoleculares con alta simetría, sola partícula EM se limita a una resolución relativamente baja (inferior a una resolución de 1 nm) de muchos ejemplares, especialmente los que no tienen simetría. Esta técnica también es limitada por el tamaño de las moléculas bajo estudio, es decir, 100 kDa para los especímenes con tinción negativa y 300 kDa para congelados-hidratados muestras en general.

Para una nueva muestra de estructura desconocida, por lo general utilizan una solución de metales pesados ​​para incorporar las moléculas de tinción negativa. La muestra se examina en un microscopio electrónico de transmisión para llevar dos dimensiones (2D) micrografías de las moléculas. Lo ideal sería que las moléculas de proteína tienen una estructura homogénea en 3D pero presentan diferentes orientaciones en las micrografías. Estas micrografías son digitalizadas y procesadas en los ordenadores como "partículas individuales". El uso de dos dimensiones y la alineación de las técnicas de clasificación, las moléculas homogéneas en el mismo punto de vista se agrupan en clases. Su promedio de mejorar la señal de formas 2D de la molécula. Después de asignar las partículas con la orientación adecuada relativa (ángulos de Euler), seremos capaces de reconstruir las imágenes de partículas en 2D en un volumen virtual en 3D.

En una sola partícula de reconstrucción en 3D, un paso esencial es el de asignar correctamente la orientación adecuada de cada partícula. Existen varios métodos para asignar el punto de vista de cada partícula, incluyendo la reconstitución angular y ^una inclinación al azar cónica (ECA) el método ^2. En este protocolo, que describe nuestras prácticas para conseguir la reconstrucción en 3D del complejo de levadura exosoma con tinción negativa EM y ECA. Cabe señalar que el protocolo de la microscopía electrónica y procesamiento de imágenes sigue el principio básico de la ECA, pero no es la única manera de realizar el método. En primer lugar, describir la manera de integrar la muestra de proteína en una capa de uranilo-Formate con un espesor comparable al tamaño de la proteína, usando una rejilla de carbono perforado cubierto con una capa de película continua de carbono fino. A continuación, la muestra se inserta en un microscopio electrónico de transmisión para recoger Untilted (0 grados) e inclinada (55 grados) pares de micrografías que se utilizará más tarde para el procesamiento y la obtención de un modelo inicial en 3D de la exosoma levadura. Con este fin, llevamos a cabo ensayos clínicos aleatorios y luego refinar el modelo 3D inicial mediante el uso de la proyección correspondiente método de refinamiento ^3.

Protocol

1. Principio del método de inclinación cónica azar El principio del método de inclinación cónica requiere tomar al azar un par de micrografías de la misma región de la muestra dentro del microscopio electrónico. Se toma una fotografía de la muestra en una posición Untilted (fig. 1A) y la otra foto se toma de la muestra inclinada en un ángulo de entre 50 y 70 grados (en nuestro caso, utilizamos 55 grados). (Fig. 1B) Usar la computadora, la pareja micrografía digitalizados se pone al lado…

Discussion

En este artículo se presenta un protocolo detallado de preparación de muestras y reconstrucción tridimensional del complejo exosoma mediante microscopía electrónica de tinción negativa. Usando este método, se obtuvo la reconstrucción en 3D utilizando el método aleatorio inclinación cónica sin ningún conocimiento previo de la estructura. Método aleatorio inclinación cónica no requiere necesariamente de una muestra homogénea, pero la proyección a juego siguientes refinamiento paso necesitaría una muestra…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Polyvinyl Formal Resin		Electron Microscopy Science	63450-15-7
Uranyl Formate		Electron Microscopy Science	22451
Superfrost Microscope Slides		Thermo Scientist	4951F-001
400 mesh grid regular		SPI Supplies	3040C
Carbon coater Auto 306		Edwards
Tecnai-12 Electron Microscope		FEI
Glow Discharger		BAL-TEC		Sputter Coater SCD 005