结扎冠状动脉内注射在小鼠模型梗死

Published: June 7, 2011 doi: 10.3791/2581

Jitka A.I. Virag¹, Robert M. Lust¹

¹Department of Physiology, Brody School of Medicine, East Carolina University

Summary

众多的遗传操作和/或心肌内注射基因，蛋白质，细胞，和/或生物材料叠加后的时间在急性缺血/再灌注损伤和小鼠慢性重塑的研究维度。该视频演示了缺血/再灌注损伤的显微外科程序，永久结扎冠状动脉内注射研究。

Protocol

无菌手术器械（表1）和3“棉倾斜涂药放在无菌underpad珠灭菌器（Germinator 500）打开。
小鼠（年龄：6个星期; WT：>18克）20μL/ g的tribromoethanol BW（250毫克;持续时间 - 约40分钟）腹腔注射麻醉。
脱毛（例如奈尔），当老鼠的反应迟钝脚趾捏，无菌润滑剂（泪续签）是适用于眼睛干燥和胸部的左侧，以保护他们的是涂有从皮肤移除的皮毛。
脱毛是温暖的自来水和优碘/酒精擦拭是用来消毒手术区冲走。
鼠标被放置在一个温暖的deltaphase温垫是固定在一个有机玻璃表。每个肢体固定用胶带和水平厚厚的线程被放置在牙顶举行的地方上颚。
该表是垂直放置和纤维的光线是直接照耀到颈部食管照明。这就需要开放的咽喉，是一个光线充足的孔口的精确位置等，从而使气管，可视化，以方便插入PE管材。
管理恒定的正压通气（TOPO的呼吸;率125次/分;高峰吸气压力10-12 _CMH 2; *注油管是连接到呼吸机（连接到95％O ₂ / 5％的_CO 2 ）设置与应变和性别1-3而异）。一旦确认同步胸部运动，通风，连接固定用胶带垫，以避免在手术拔管。
使用齿钳拉皮肤远离胸部，10＃无菌手术刀刀片连接到＃3手术刀的处理是用来在皮肤平行的胸骨1.5厘米切口。
弯曲万纳microscissors用于切割胸大肌肌肉，使肋间肌的小孔。
直，钝microscissors用于切割通过3肋骨。
采用9mm小儿眼科镜是用于收回的左肋。
用弯钳，拉离心脏和心包用有齿镊轻轻撕裂它打开。
下方的左前降冠状动脉前（沿心脏的长轴）缝合8-0聚乙烯使用的Castroviejo持针器，采用6mm锥形点3 / 8针线程垂直于它。
1. 定时再灌注，可用于删除一个临时结扎，消毒0.5 - 1CM PE90片是对心脏冠状动脉平行。缝合，首先根据冠状动脉循环，然后绑在油管。当时它被释放，放松结扎。这可以反复进行，根据需要和闭塞/再闭塞的^时间可以修改4。根据协议和使用麻醉类型的长度，补充可能是必要的。
2. 一个永久性闭塞，股价下冠状动脉结扎是简单的并列。漂白和运动障碍是显而易见的，长的缝合结束削减^5-10。
3. 对于内注射（S），汉密尔顿30号无菌针头斜面无菌注射器引入上述损伤结扎右侧区域的核心基地。到损伤区，然后将针先进撤回轻微斜角可以约在边境区。一些在注射器（2 - 3μl）溶液注入心针是在地方举行。撤回另1 - 3mm的注射器和解决方案的其余部分被注入。注射器举行，直至形成的解决方案是由气泡消散。然后取出针。如果有任何出血，棉签轻轻压入针插入部位，直到出血^停止 5-7 。
一旦心肌操作完成后，肋骨拉钩将被删除，使用6-0 surgipro缝合2-3床垫缝线关闭胸腔。
两三个床垫缝合，然后关闭胸大肌肌肉，0.25％marcaine 1:10在无菌生理盐水（0.1ml/25g鼠标）1-3滴，适用于肌肉，然后2-3床垫缝线作出关闭的皮肤。
鼠标是从呼吸中删除。一旦有节奏，快速，呼吸浅验证，鼠标就可以拔管。
0.5毫升温暖的无菌生理盐水注入背侧皮下空间和鼠标放置在一个笼子里的变暖垫，直到它恢复流动性（1小时最低）。
生存实验中，小鼠被放置到他们的笼子，直到牺牲时返回到动植物公园。在第2天，蘸食品放在笼地板上，以方便饲养（所以他们没有达到这可能会导致疼痛）和丁丙诺啡，应每6 - 12小时。手术后的护理，还包括验证充足的流动性，疏导和饮食习惯的第一个星期的日常监测。
手术器械用乙醇擦拭干净，并插入珠未来手术前灭菌。
牺牲时，小鼠的戊巴比妥钠（65mg/ml; 55-65毫克/公斤）麻醉。当达到足够的麻醉平面，打开胸腔。
虽然心脏还在跳动，注射器与含冷氯化钾的23号针（氯化钾，30MM）或2,3 - 丁二酮肟（BDM; 10MM）用于穿刺后脑室底部区域和解决方案慢慢注入室，直到心脏在舒张被捕。
心一旦被删除，使用注射器含PBS逆行灌注冲洗，以消除任何血液，仍然心。对于急性研究，在再灌注期的结束，法援署重新结扎在闭塞的原始点。主动脉注入含有1％的埃文蓝色，是一个解决方案。一旦心脏中提取，这是横向切割同等厚度分为3个部分，在1％2,3,5 -三苯基氯化孵育，和¹¹个形态分析成像。对于慢性的研究，心是那么沉浸在固定液，然后按常规程序处理和嵌入式。幻灯片可以染色组织学和形态分析（使用接穗，美国国立卫生研究院图像J或图像临加^）9,10,12成像。

代表性的成果：

当操作正确，在小鼠的存活率（男：年龄8-10个星期，22 - 28G，女性年龄在10至12周，20 - 26G）：超过90％的急性缺血/再灌注和缺血预处理实验，超过永久动脉结扎术的研究，85％和心肌内注射约80％。由于早期损伤是更容易代谢的变化，而不是结构，在缺血/再灌注心肌梗死大小的决心和缺血预处理实验执行注入到的主动脉这将灌注心，是不是由法援署提供1％的埃文的蓝色染料可见（图1A）。一旦心脏被删除，横向切一半，组织培养在1％的2,3,5 - 三苯基氯化测量梗死面积（图1B）的解决方案。该地区使用接穗或美国国立卫生研究院图像处理软件可以使用在相同的放大倍率成像千分尺进行校准。这些数字是用来计算风险/左心室心肌梗死面积/风险¹¹区的区。应变的差异可能会导致体重和心脏的大小，所以应采取这些措施规范化，心脏重量，体重，或胫骨的长度为便于比较的变化。

常驻动脉结扎总值的结构性变化，如坏死，管壁变薄，腔扩张。治疗和/或梗死面积和左心室，室面积，室间隔和左室游离壁的厚度在永久性闭塞模型（图2A）坏死相对时间的影响比较，也可以使用接穗或美国国立卫生研究院成像测量软件。 picrosirius红/快绿（图2B）胶原染色可以用来衡量insterstitial纤维化与功能指数壁变硬^8-10。图3中的形象代表6ul溶液注射到心脏的边境地带，永久动脉结扎后（Evan的蓝色）的分布。请注意，它伤害的方向进行，以及向基地也transmurally。

图1。 A.埃文的蓝色注入主动脉前切除 ，此图像显示了心（染色）和闭塞的区域（未染色）灌注地区。B.埃文的蓝和TTC染色急性缺血/再灌注损伤。这是一个形象代表（20倍），显示的蓝色染料染色unoccluded地区以及代谢可行的组织TTC染色（红色）的分布。坏死区不染色，所以他们仍然苍白（概述）。

图2。 A.苏木精和伊红染色，这是一个形象代表的H＆E染色削减横在4天的梗死区域的心肌梗死后（20倍）通过一个小鼠心脏（20X）。 *为组织坏死，箭头指向肉芽组织，RV =右心室和LV =左心室。 Picrosirius红色和绿色快速染色，这是一个picrosirius红/快速绿色染色心肌梗死后4周的小鼠心脏截面的形象代表（20X）。细胞质内渍绿色和胶原纤维是红色的。

图3。埃文的蓝色染料染色分布6ul内注射。显示全球的埃文蓝色染料和透心整个6ul在边境地带内注射后立即结扎冠状动脉（12X）的分布，这是一个形象代表。

Discussion

冠心病仍然是一个流行病学和财政重大的公共卫生问题。大量的基础研究仍然需要了解的机制，其中损伤和重塑进行潜在疗法可以调节这些过程，如果他们将被开发为临床使用。鼠害是最常用的和广泛的转基因小鼠可使得这个物种更具吸引力的模式。

虽然有老鼠和其他物种之间的差异，也有一个小鼠模型的诸多优点。使用一个简单的解剖范围或放大镜，光线充足的条件下，使血管容易看出（详细的大体解剖，血管，看到萨尔托Tellez等^，2004年13）。为了减少手术后的死亡率的风险，这是非常重要，以避免切断大血管，因为一个25克鼠标的^总血量低于2毫升14。在事件发生出血过多，温柔的压力或查明烧灼的应用可用于止血。

此过程也可以在多种方式进行修改。例如，老鼠可以使用异氟醚，氯胺酮/甲苯噻嗪，或戊巴比妥钠和适当的选择是由确定的^协议的期限15-18的麻醉。脚趾捏反射是最常用的麻醉深度的指数。此外，为了改善长期生存的可能性，一些研究人员使用抗心律失常药物，如利多卡因，以减少致命性^心律失常 19,20然而，它必须考虑到这最近已被证明具有抗细胞凋亡在急性属性的发生率模型^21。此外，为减少手术后的疼痛，止痛药，包括丁丙诺啡可管理的第一个48小时的手术^后 3,16,17,22,23 。为了保持身体在手术过程中的温度（尤其是较长的协议），在加热垫系列直肠探头通常用于恒温垫。对于缺血/再灌注和/或缺血前或后处理：可以改变闭塞（S）和再灌注（S）的持续时间;永久性闭塞，梗死面积可能通过调整结扎的位置修改;心肌内注射（如细胞，蛋白质等），可以有1-3注射地点和每次注射量可高达^15μL24 。如果细胞被注入，用于衡量针（通常^{26-30）5,25,26}选择应根据细胞的大小，使针的内部直径足够大，以避免sheering。为了避免混淆由于手术引发的炎症过程，一些研究人员报告说，使用一个圈套，操纵体内闭塞和reperfuse在一个封闭的胸部鼠标的心，在^任何手术后27-29点。最近，高³⁰ 等。表明，可以进行临时和永久性闭塞不通风的需要，一些实验室已经开始使用超声波来执行封闭胸部心肌内^注射 25,31 。

由于由约翰和奥尔森发表于1954年³²的第一项研究中，证明在小鼠冠状动脉结扎的可行性，许多人都采用这种模式，并修改它来研究各方面的^心肌损伤和重塑3,33-45。小鼠的大小，生殖能力，并购买和维护费用相对较少方面的性质，使这一物种的生理和病理生理研究的广泛吸引力的工具。由于在体内的进步^46-49成像的小型化技术，以及执行和分析大型基因组学和蛋白组学，药物筛选，以及基于细胞和/或蛋白质疗法的^疗效的生物材料50-64，结合心肌梗死的小鼠模型的范围越来越广，无处不在的或组织的特定的基因或突变体/基因敲除小鼠所提供的遗传操作，无疑将继续在评估急性心肌损伤和长期重塑的宝贵工具。因此，有不容置疑的价值能够可靠和可重复执行这些实验。

Disclosures

这种动物协议的批准和机构在东卡罗来纳大学的动物护理和使用委员会提出的准则和法规的规定。

Acknowledgments

我想感谢提供资金，以支持他们的警惕和援助我的研究和比较医学部的研究和研究生部。我也想生理学教研室的支持和指导以及在我的实验室技术人员和学生认识到他们的帮助。最后，我要感谢我的博士后导师，博士查尔斯E.默里，培训机会，在此期间，我学到了小鼠显微。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Vanna Scissors	George Tiemann & Co.	160-159
Micro Dissecting Scissors	George Tiemann & Co.	160-161
Forceps – straight, 1x2 teeth	George Tiemann & Co.	105-205
Scalpel handle #3	George Tiemann & Co.	105-64	#10 sterile blade
Forceps – half curved serrated	George Tiemann & Co.	160-19
Tissue Scissors	George Tiemann & Co.	105-410
Castroviejo Needle Holder	Miltex Inc.	18-1828
Cook Eye Speculum	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Germinator 500 Bead Sterilizer	Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase isothermal pad	Braintree Scientific, Inc.	39DP
Hamilton syringe - 25μl	Hamilton Co	80430
30 gauge beveled needle	Hamilton Co	7803-07
Ventilator	Kent Scientific	TOPO