Summary
Nucleosome एलिसा (NU एलिसा) एक संवेदनशील और मात्रात्मक देशी, अक्षत nucleosomes की तैयारी में बाद translational संशोधनों के वैश्विक पैटर्न का पता लगाने की विधि है. इन संशोधनों methylations, acetylations, और विशिष्ट histone अमीनो एसिड के अवशेष पर phosphorylations शामिल हैं, और इसलिए परमाणु एलिसा विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के समग्र chromatin संशोधन राज्यों के एक वैश्विक प्रोटिओमिक परख प्रदान करता है.
Abstract
eukaryotes के जीनोम chromatin के रूप में मौजूद है जो दोनों के डीएनए और प्रोटीन होते हैं. chromatin की मौलिक इकाई nucleosome है, जो 146 डीएनए के आधार जोड़े दो H2A, H2B, H3, और H4 1 histones में से प्रत्येक के साथ जुड़े होते है. Histones के एन टर्मिनल पूंछ lysine और arginine में धनी होते हैं और एसिटिलीकरण, मेथिलिकरण, और अन्य बाद translational संशोधनों (PTMs) के बाद transcriptionally संशोधित. Nucleosomes के PTM विन्यास जुड़े डीएनए के transcriptional गतिविधि को प्रभावित करते हैं, इस प्रकार जीन विनियमन की एक विधा है कि 2,3 प्रकृति में epigenetic है प्रदान कर सकते हैं. हम एक nucleosome एलिसा (NU एलिसा) मात्रात्मक कोशिकाओं से निकाले nucleosomes की वैश्विक PTM हस्ताक्षर निर्धारित करने के लिए बुलाया विधि विकसित की है. परमाणु - एलिसा और अधिक संवेदनशील और सोख्ता पश्चिमी मात्रात्मक है, और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के epiproteomic राज्य पूछताछ के लिए उपयोगी है. यह वीडियो पत्रिका आलेख विस्तृत प्रक्रियाओं का पता चलता है कि परमाणु - एलिसा विश्लेषण करने के लिए.
Protocol
1. स्तनधारी सेल संस्कृति
परमाणु एलिसा किसी भी स्तनधारी कोशिका प्रकार है कि संस्कृति में उगाया जा सकता है है पर किया जा सकता है है. हम कोशिकाओं के बड़े समूहों के लिए उदार तैयार इतना है कि nucleosomes पर्याप्त मात्रा में अलग किया जा सकता है है कई हूबहू लोड एलिसा प्लेटें तैयार पसंद करते हैं, इस प्रकार के कई अलग अलग एंटीबॉडी (ABS) के साथ assays अनुमति. निम्नलिखित संस्कृति तराजू पर्याप्त सामग्री प्रदान करते हैं:
माउस embyronic स्टेम कोशिकाओं के लिए, कक्षों की एक या दो 15 सेमी प्लेटें फीडर कोशिकाओं के बिना हो जाना. Fibroblasts के लिए, संगम के लिए 5 से 10 15 सेमी प्लेटें बढ़ता है.
2. नाभिक के अलगाव
नोट: सभी कदम पूर्व ठंडा buffers के साथ बर्फ पर हैं, सिवाय के रूप में संकेत दिया.
- 3 प्लेट प्रति मिलीलीटर trypsin के साथ कोशिकाओं Trypsinize, गठबंधन, और बर्फ ठंड पीबीएस / butyrate के 20 मिलीलीटर जोड़ने. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- 10 मिलीलीटर पीबीएस / butyrate में कोशिकाओं Resuspend और 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- Protease inhibitors (सिग्मा Aldrich पी ८३४०) के साथ 4 मिलीलीटर lysis बफर में Resuspend है. Dounce प्रकार बी मूसल के साथ बर्फ पर 20 स्ट्रोक homogenize.
- 4 में 10 मिनट के लिए 2000g पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस (सतह पर तैरनेवाला cytoplasm, जो इस प्रोटोकॉल के लिए की जरूरत नहीं है, लेकिन यह अन्य उपयोगों के लिए बचाया जा सकता है अगर वांछित).
- 2 मिलीलीटर बर्फ ठंड धो बफर सी में गोली (protease inhibitors के साथ) Resuspend.
- परत 5 मिलीलीटर 30% sucrose गद्दी पर resuspended सामग्री, तो झूल बाल्टी रोटर में 5 मिनट के लिए 2400g पर अपकेंद्रित्र. नाभिक तकिया के माध्यम से विस्थापित हो, और मलबे इंटरफेस में रहता है.
- सभी तरल की मात्रा को ध्यान से निकालें और 250 μl बर्फ ठंड धो बफर सी + protease inhibitors में नाभिक resuspend.
3. सीटू Micrococcal Nuclease पाचन (MNase) में Nucleosomes के द्वारा अलगाव
हम एक प्रक्रिया में जो chromatin बगल में नाभिक के भीतर उन्हें MNase साथ infusing, hypotonic सतह पर तैरनेवाला में मुफ्त बरकरार nucleosomes ड्राइव उपचार द्वारा पीछा करके पचता है उपयोग करें.
- नमूना 3 μl 0.1 एम 2 CaCl जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में रखो. 37 डिग्री सेल्सियस तापमान ग्रहण करने के लिए अनुमति दें.
- 2 इकाइयों MNase (Micrococcal Nuclease, सिग्मा Aldrich, MNase बफर में 2 units/10μl में भंग) जोड़ें, तो 37 के लिए सेते ° 12 मिनट, अक्सर एक pipet टिप का उपयोग कर मिश्रण के साथ के लिए सी.
- की प्रतिक्रिया को रोकने के 0.5 ना EDTA एम, 8.0 पीएच 6 μl जोड़ें. बर्फ पर रखो.
- 4 मिनट के लिए 2000g पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 300 μl 0.2 मिमी ना EDTA में गोली Resuspend. सामयिक कोमल pipeting के साथ 1 घंटे के लिए बर्फ पर स्टोर. (ये hypotonic शर्तों नाभिक से मुक्त nucleosomes आजाद कराने).
- 4 में 4 मिनट के लिए जी 3000 में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला है, जो मुक्त nucleosomes शामिल बर्फ पर, सहेजें.
- गोली फिर Resuspend 300 μl 0.2 मिमी ना EDTA के साथ. सामयिक कोमल pipeting के साथ 1 घंटे के लिए बर्फ पर स्टोर.
- 4min के लिए 3000g पर 4 पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला बनाए रखने और 5 कदम से पहले सतह पर तैरनेवाला के साथ गठबंधन. परिणामस्वरूप mononucleosome तैयारी और aliquoted -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है है
नोट: chromatin की राशि crudely एक 10 μl नमूने के 260 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा quantitated किया जा सकता है है पानी के 990 μl जोड़ा. एक 260 = 10 (1 / 100 मन्दन के लिए समायोजन के बाद) के बारे में chromatin के 1mg/ml मेल खाती है. इसके अलावा, इसके बाद के संस्करण की प्रक्रिया के दौरान, छोटे नमूनों और बनाए रखा जा सकता है बाद में विश्लेषण उनके डीएनए सामग्री के लिए गुणवत्ता और MNase digestions की हद तक है, जो मुख्य रूप से लंबाई में 146 बीपी के डीएनए को शामिल करना चाहिए की निगरानी. Laddering अधूरा MNase पाचन के संकेत है.
नोट: Fig.1 परमाणु अलगाव और MNase digestions चरणों के diagrammed सारांश शामिल हैं.
4. Nucleosome एलिसा (परमाणु एलिसा)
हम देशी बरकरार nuclesosomes है कि अच्छी तरह से 96 एलिसा microtiter प्लेटों पर स्थिर है युक्त भिन्न पर PTMs का पता लगाने. प्रत्येक नमूने के लिए, हम 2 गुना dilutions की एक श्रृंखला बनाने के लिए, और इन तीन प्रतियों में कुओं पर लेपित हैं.
- कोट MaxiSorp 4 ° 50 μl / अच्छी तरह से कोटिंग बफर में पतला nucleosomes के साथ सी. रातोंरात प्लेटें सुझाव धारावाहिक दुगना dilutions nucleosomes की शीर्ष पंक्ति नीचे पंक्ति से 0.1 μg, 0.05 μg, 0.025 μg, 0.0125 μg, .००,६२५ μg, 0.००,३१३ μg, .००,१५६ μg जोड़कर तैयार कर रहे हैं कोटिंग केवल नीचे में बफर (0 μg chromatin) के साथ, पंक्ति. (नोट: थाली कवर इस कदम के लिए आवश्यक हैं.)
- सुबह में, प्लेटें एक थाली वॉशर के साथ एक 10 मिनट की एक संयुक्त कुल के लिए 4 बार धोने 200 μl / अच्छी तरह से कमरे के तापमान (आर टी) पर PBS/0.5 बीच 20% के साथ.
- ब्लॉक 100 μl / PBS/0.05% BSA बीच-20 / 5% के साथ आरटी पर 1 घंटा.
- उल्टे थाली briskly झटकों से अवरुद्ध बफर निकालेंएक सिंक पर. कवर और -20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों की दुकान, या अगले कदम के लिए सीधे जाओ.
- 50 μl / अच्छी तरह पतला 1:1000 के PBS/0.05% बीच 20 / 5% BSA, एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते में (या के रूप में की जरूरत) की मात्रा में 1 ° Abs जोड़ें.
- प्लेटें 200 μl / अच्छी तरह से आरटी पर PBS/0.5 बीच 20% के साथ और एक थाली वॉशर में एक 10 मिनट की एक संयुक्त कुल के लिए 4 बार धोएं.
- घोड़े की मूली peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित 2 ° Abs, 1:5000 PBS/0.05% बीच 20% / 5 एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर एक घंटे के लिए आरटी पर BSA में (या के रूप में की जरूरत) पतला जोड़ें.
- प्लेटें 200 μl / अच्छी तरह से PBS/0.5 बीच 20% के साथ 4 बार धोएं. प्रत्येक धोने के साथ एक थाली वॉशर आरटी और 10 मिनट की कुल के लिए है.
- आरटी से कम 10 मिनट के लिए एक अच्छी तरह से TMB सब्सट्रेट के 50 μl जोड़कर प्लेटों का विकास करना. 50 μl / अच्छी तरह से 2N एच 2 अतः 4 जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो और प्लेटें पढ़ने के 450 एनएम . (टिप: 2 मिनट के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र एक थाली रोटर का उपयोग कुओं में किसी भी हवाई बुलबुले को फैलने से पहले पढ़ने absorbances).
- स्प्रेडशीट फ़ाइलों मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए रीडिंग निर्यात.
अभिकर्मकों
| / पीबीएस butyrate |
| 135 मिमी NaCl |
| 2.5 मिमी KCl |
| 8 मिमी ना 2 4 HPO |
| 1.5 मिमी 2 के.एच. पीओ 4 |
| 10 मिमी ना - butyrate |
| Lysis बफर |
| 250 मिमी sucrose |
| 10 Tris - एचसीएल मिमी, 7.4 पीएच |
| 10 मिमी ना - butyrate |
| 4 मिमी 2 MgCl |
| 0.1% Triton एक्स - 100 |
| धो बफर सी |
| 250 मिमी sucrose |
| 10 Tris - एचसीएल मिमी, 7.4 पीएच |
| 10 मिमी ना - butyrate |
| 4 मिमी 2 MgCl |
| Sucrose तकिया |
| 30 (w / v)% धोने बफर सी में sucrose |
| Microccocal Nuclease बफर |
| 5 मिमी NaPO 4 बफर, पीएच 7.0 |
| 0.025 मिमी 2 CaCl |
| कोटिंग बफर |
| 80ml समाधान ए + समाधान 170ml B + 250ml DH 2 हे |
| समाधान एक: 0.2 एम ना 2 3 सीओ |
| समाधान बी: 0.2 एम 3 NaHCO |
5. प्रतिनिधि परिणाम
विधि NU एलिसा, कई समान प्लेटों की एक श्रृंखला है जो के साथ chromatin mononucleosomes के रूप में तैयार लोड किया जा सकता है तैयार. आम तौर पर हम हूबहू भरी हुई प्लेटें इतना है कि प्रत्येक अलग विरोधी PTM विशिष्ट एंटीबॉडी (ABS) के साथ जांच किया जा सकता है है की श्रृंखला तैयार करते हैं. हम भी हमेशा एक प्लेट है कि एक अब है कि उनके संशोधन राज्य कुल chromatin लोडिंग नियंत्रण के संबंध के बिना histones का पता लगाता है के साथ जांच किया जा सकता है तैयार. यह नियंत्रण आवश्यक है क्रम में बाद में मात्रात्मक विभिन्न नमूनों से तैयार nucleosomes के PTM सामग्री की तुलना है. एक दिया chromatin नमूना भीतर PTMs के स्तर quantitate हम कच्चे absorbance के इस दृष्टिकोण का उपयोग मूल्यों को सही: पहले, हम किसी भी पृष्ठभूमि नियंत्रण नहीं chromatin (पृष्ठभूमि आमतौर पर नगण्य है) युक्त कुओं से प्राप्त मान का उपयोग करते हुए संकेत घटाना. हम तो परमाणु एलिसा एक समान लोड थाली है कि एक अब है कि उनके संशोधन राज्य की स्वतंत्र nucleosomes का पता लगाता है साथ assayed किया गया था से प्राप्त परिणामों के लिए PTM विशिष्ट संकेत मानकीकरण. (हम इस उद्देश्य के लिए पॉलीक्लोनल histones H2A या H2B के लिए विशिष्ट Abs का इस्तेमाल किया है). हम तो chromatin में से प्रत्येक के कमजोर पड़ने के लिए अर्थ और प्रसरण निर्धारित करते हैं, और एलिसा परख के रैखिक भाग से प्राप्त डेटा का उपयोग. परमाणु एलिसा गणितीय और सांख्यिकीय विश्लेषण के विस्तृत उदाहरण 4 पहले सूचित किया गया है
चित्रा 1. परमाणु - एलिसा चरणों के योजनाबद्ध diagam. ए स्तनधारी कोशिकाओं से harvested रहे हैं, बी नाभिक कोशिकाओं से Dounce घंटे के द्वारा अलग कर रहे हैंomogenization, सी. बाधित कोशिकाओं एक 30% w / ध् sucrose, centrifugation के बाद तकिया डी. के शीर्ष पर लोड कर रहे हैं, नाभिक गोली में जमा कर रहे हैं, ई, एफ chromatin MNase द्वारा मुख्य रूप से mononucleomes के बगल में पच जाता है, जी , एच मैं घुलनशील mononucleosomes hypotonic उपचार और अवशिष्ट परमाणु सामग्री के दोहराया centrifugation द्वारा निकाले जाते हैं और विभिन्न नमूनों से जे Mononucleosomes (लेबल samp इस मामले में 1 और 2.) microtiter कुओं पर हूबहू - भरी हुई प्लेटें की श्रृंखला में लेपित हैं और साथ पूछताछ PTM-विशिष्ट Abs और PTM-स्वतंत्र Abs के कुल chromatin लोड हो रहा है निर्धारित अंतर संकेत का पता लगाने के स्तर के दो नमूने है कि उनके PTM सामग्री में अलग लालकृष्ण चित्रण, अभी तक इसी तरह समग्र chromatin सामग्री है, के रूप में विरोधी H2B immunoreactivity द्वारा न्याय.
Discussion
परमाणु - एलिसा nucleosome एक विशेष सेल प्रकार के भीतर मौजूद PTMs की वैश्विक स्थिति का पता लगाने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. परमाणु - एलिसा अध्ययन से पता चला है कि वैश्विक nucleosome संशोधन राज्यों मुक़्तलिफ़ सेल 4 प्रकार की तुलना में अलग हैं. इसके अलावा, परमाणु एलिसा PTM प्रोफाइल बदल जब कोशिकाओं जैसे epigenetic modulatory एजेंट को उजागर कर रहे हैं trichostatin - एक या जब माउस embyronic स्टेम कोशिकाओं 4 भेदभाव कर रहे हैं. विधि को भी सफलतापूर्वक लागू किया गया है है मानव ES 5 कोशिकाओं के chromatin अध्ययन . यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें करने के लिए परमाणु एलिसा, अपने वर्तमान स्वरूप में, केवल सेलुलर epigenome की कुल राशि के भीतर मौजूद PTMs के संयुक्त हस्ताक्षर का पता लगा सकते हैं. इस जीनोम चौड़ा chromatin immunoprecipitation, जो विशिष्ट आनुवंशिक loci भर में एक विशिष्ट PTM का वितरण निर्धारित कर सकते हैं से स्पष्ट रूप से अलग है.
परमाणु - एलिसा प्रक्रियाओं के प्रारंभिक चरणों पिछले तरीकों से अनुकूलित कर रहे हैं स्तनधारी 6,7 नाभिक से mononucleosomes अलग. इन अनुकूलित तरीकों एक समीचीन स्तनधारी कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता बरकरार mononucleosomes प्राप्त करने का तरीका प्रदान करते हैं, और जिसके परिणामस्वरूप भिन्न उनके chromatin सामग्री में व्यापक हैं, लेकिन अतिरिक्त परमाणु सामग्री की एक महान सौदे होते हैं. चूंकि विशिष्ट Abs का उपयोग किया जाता है, गैर nucleosomal सामग्री contaminating NU - एलिसा परख में अच्छी तरह से सहन किया है जन कल्पना दृष्टिकोण है कि अधिक से अधिक शुद्धता की आवश्यकता के विपरीत,. हालांकि, परमाणु - एलिसा पश्चिमी सोख्ता 4, इस प्रकार westerns और nucleosomal PTMs का पता लगाने के लिए बड़े पैमाने पर कल्पना के लिए अच्छा विकल्प प्रदान करने की तुलना में अधिक संवेदनशील और मात्रात्मक है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
परमाणु - एलिसा विधि का विकास NIH अनुदान RO1AG023687 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micrococcal Nucleae | Sigma-Aldrich | N3755 | Make aliquots of 2 U/10μl buffer, stored at -20°C |
| Nunc MaxiSorp Microtiter Plates | Fisher Scientific | 12-565-135 | Adhesive plate covers can also be ordered through Fisher |
| Automated Plate Washer | |||
| 1-Step TMB-ELISAsubstrate | Pierce, Thermo Scientific | 34028 | Store at 4°C pre-warm to RT before use or as directed on the specification sheet |
| Microtiter Plate Reader | Bio-Rad | Most colorimetric plate reader models are suitable |
References
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Turner, B. M. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. 22, 836-845 (2000).
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- Tanasijevic, B. Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture. Epigenetics. 4, 330-338 (2009).
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