Summary
Die Kenntnis der genauen Anzahl der lebensfähigen Zellen ist für viele Gewebekultur Manipulationen erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt, wie man zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden und zu quantifizieren Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Obwohl es das Zählen menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) beschreibt, kann es für andere Zelltypen verwendet werden.
Abstract
Die Kenntnis der genauen Anzahl der lebensfähigen Zellen in einem bestimmten Volumen einer Zellsuspension ist für viele Routine Gewebekultur Manipulationen, wie Plattieren Zellen für Immunzytochemie oder für Zell-Transfektionen erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und schnelle Methode zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen und die Quantifizierung der Zellkonzentration und insgesamt Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers. Dieses Verfahren erfordert zunächst Ablösung von Zellen aus einem Wachstum Oberfläche und Resuspendieren sie in den Medien. Anschließend werden die Zellen in eine Lösung von Trypanblau (im Idealfall bis zu einer Konzentration, die 20-50 Zellen pro Quadrant geben wird) verdünnt und in die Hämazytometer. Schließlich, im Durchschnitt der Grafen von lebensfähigen Zellen in mehreren zufällig ausgewählten Quadranten, indem die durchschnittlich um das Volumen eines 1 mm 2-Quadranten (0,1 ul) und Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor ergibt die Anzahl der Zellen pro l. Multipliziert man diese Zellkonzentration durch das Gesamtvolumen in ul gibt die Gesamtzahl der Zellzahl. Dieses Protokoll beschreibt das Zählen menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs), kann aber auch für viele andere Zelltypen verwendet werden.
Protocol
Passagierung humaner neuraler Stammzellen
Hinweis: Bitte beachten Sie die Passagierung Nervenstammzellen Artikel auf, wie zu lösen, und Zellen. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
Vorbereitung der Zellsuspension für Counting
- Platz 25 ul von 0,4% Trypanblau-Lösung und 20 ul der Zelle Medien in ein Eppendorf-Röhrchen.
- Resuspendieren der Zellen, um durch leichtes Antippen des Röhrchens mit den Zellen in einem bekannten Volumen von Medien, um eine homogene Suspension zu schaffen gezählt werden. Platz 5 ul der Zellen in das Eppendorf-Röhrchen aus dem vorherigen Schritt. Dieser Schritt verwässert die Zellkonzentration um den Faktor 10.
- Legen Sie die Abdeckung Glas auf dem Hämazytometer und Last ca. 11-12 ul der Zellsuspension.
Zählen von Zellen in der Hämazytometer
- Beachten Sie die gesamte Raster der Hämazytometer in einem Phasenkontrastmikroskop. Konzentrieren Sie sich auf einen Quadranten des Rasters (wie die in rot).
- Tote oder sterbende Zellen erscheinen blau, weil ihre Membran beschädigt wurde und nicht in der Lage, die Trypanblau auszuschließen. Lebende Zellen werden nicht angezeigt, blau und wird von einem "Halo" von Licht im Phasenkontrast (wird "Phase-hell") umgeben sein.
- Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in einem Quadranten (Bereich 1 mm 2). Sie können auch bestimmen, die Lebensfähigkeit der Zellen, indem die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen. Zählen von Zellen in 3-4 zufällige Quadranten und der Ermittlung der durchschnittlichen Anzahl der Zellen pro Quadrant. Da das Volumen eines Quadranten ist bekannt, dass 10 -4 ml oder 0,1 ul werden, kann die Konzentration von Zellen bestimmt werden
- Sie können folgende Verknüpfung mit der #-Zellen / ul zu bestimmen:
Gesamtanzahl von Zellen in Rohr = # Zellen / ul ul X in Rohr
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und schnelle Weg, um die Zellkonzentration für eine Vielzahl von Experimenten mit Zellen zu bestimmen. Mit der Verknüpfung in 3d beschrieben, kann man schnell und genau zu bestimmen, die Zellkonzentration und insgesamt Zellzahl in einem bestimmten Volumen.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Philip H. Schwartz des National Human Neural Stem Cell Ressourcen auf die Kinder s Hospital, Orange County Forschungsinstitut für die Bereitstellung hNSPC Kulturen anzuerkennen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
