Summary
El conocimiento del número exacto de células viables se requiere para muchos manipulaciones de cultivo de tejidos. Este protocolo describe cómo diferenciar entre células vivas y muertas y cuantificar las células usando un hemocitómetro. A pesar de que describe contar humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), que puede ser utilizado para otros tipos celulares.
Abstract
El conocimiento del número exacto de células viables en un determinado volumen de una suspensión celular que se requiere para las manipulaciones rutinarias de cultivo de tejidos, como las células de revestimiento de inmunocitoquímica o para transfecciones celulares. Este protocolo describe un método sencillo y rápido para diferenciar entre células vivas y muertas y la cuantificación de la concentración celular y el número total de células con un hemocitómetro. Este procedimiento requiere en primer lugar separar las células de la superficie de crecimiento y resuspensión de ellos en los medios de comunicación. A continuación, las células se diluyen en una solución de azul tripán (idealmente a una concentración que dará a 20-50 células por cuadrante) y se coloca en el hemocitómetro. Por último, el promedio de los conteos de células viables en varios cuadrantes seleccionados al azar, dividiendo el promedio por el volumen de un cuadrante de 1 mm 2 (0,1 l) y multiplicar por el factor de dilución da el número de células por l. Al multiplicar esta concentración de células por el volumen total en l da el número total de células. Este protocolo describe contar humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), pero también se puede utilizar para muchos tipos de células.
Protocol
Pases células madre neurales humanas
Nota: Consulte la pases Humanos células troncales nerviosas artículo sobre cómo separar y volver a suspender las células. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
Preparación de la suspensión celular para el recuento
- Lugar 25 l de 0,4% de la solución azul de tripano y 20 l de los medios de comunicación celular en un tubo eppendorf.
- Resuspender las células para ser contadas golpeando suavemente el tubo que contiene las células en un volumen conocido de los medios de comunicación para crear una suspensión homogénea. Lugar 5 l de células en el tubo eppendorf de la etapa anterior. Este paso se diluye la concentración de células en un factor de 10.
- Coloque la cubierta de vidrio en el hemocitómetro, y la carga de 11-12 l de la suspensión celular.
El recuento de células en el hemocitómetro
- Observar toda la red del hemocitómetro en un microscopio de contraste de fase. Se centran en un cuadrante de la red (como el de rojo).
- Células muertas o moribundas que aparecen de color azul debido a su membrana ha sido dañada y no se puede excluir el colorante azul de tripano. Las células viables no aparecen de color azul y estará rodeada por un "halo" de luz en contraste de fase (se "fase brillante").
- Cuente el número de células viables en un cuadrante (zona 1 mm 2). También se puede determinar la viabilidad celular mediante la división del número de células viables por el número total de células. Recuento de células en 3-4 cuadrantes al azar y determinar el número promedio de células por cuadrante. Dado que el volumen de un cuadrante se sabe que es de 10 ml-4 o 0,1 l, la concentración de células se puede determinar
- Puede usar los siguientes métodos abreviados para determinar las células # / l:
Número total de células en el tubo = # células / X l l en el tubo
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Discussion
Este protocolo describe de una manera sencilla y rápida para determinar la concentración de células para una variedad de experimentos con las células. Utilizando el método abreviado descritas en 3D, una forma rápida y precisa de determinar la concentración de células y el número total de células en un volumen determinado.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Dr. Philip H. Schwartz de la Comisión Nacional de Recursos Humanos de las células madre neurales en el Hospital Infantil s, Condado de Orange el Instituto de Investigación para proporcionar culturas hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
