Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

इमेजिंग सी. एलिगेंस एक Epifluorescent माइक्रोस्कोप और ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग भ्रूण

doi: 10.3791/2625 Published: March 24, 2011

Summary

Abstract

गुणसूत्र विधानसभा अलगाव, और cytokinesis जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं, स्वाभाविक गतिशील हैं. जीवित कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग, फ्लोरोसेंट लेबल संवाददाता प्रोटीन या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग, जो अन्यथा तय नमूने 1,2 के विश्लेषण से inferred है इन गतिशील घटनाओं के अस्थायी प्रगति की परीक्षा के लिए अनुमति देता है . इसके अलावा, सेलुलर प्रक्रियाओं के विकास के नियमों के अध्ययन के विकास के दौरान एक अक्षुण्ण जीव पर समय चूक प्रयोगों का आयोजन आवश्यक. Caenorhabiditis एलिगेंस भ्रूण प्रकाश पारदर्शी है और एक तेजी से, 3 वंश एक ज्ञात सेल के साथ अपरिवर्तनीय विकासात्मक कार्यक्रम है, इस प्रकार सेल 4,5 और 6-9 विकास जीव विज्ञान में सवालों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रयोग मॉडल प्रदान सी.. एलिगेंस आगे आनुवंशिकी (यादृच्छिक mutagenesis के 10,11 पर आधारित) और रिवर्स करने के लिए विशिष्ट जीन को लक्षित आनुवंशिकी (आरएनएआई की मध्यस्थता हस्तक्षेप के आधार पर और लक्षित 12-15 mutagenesis के) द्वारा आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए शोधने योग्य है . इसके अलावा, ट्रांसजेनिक जानवर आसानी से हो fluorescently टैग प्रोटीन संवाददाताओं से या 16,17 व्यक्त बनाया जा सकता. ये लक्षण आनुवंशिक 18-21 vivo में मौलिक सेलुलर और विकास की प्रक्रिया का विनियमन रास्ते की पहचान करने के लिए इसे आसान बनाने के लिए गठबंधन. इस प्रोटोकॉल में हम रहते इमेजिंग के लिए सी. के तरीकों वर्तमान एलिगेंस एक यौगिक epifluorescent खुर्दबीन पर डीआईसी प्रकाशिकी या GFP प्रतिदीप्ति का उपयोग भ्रूण . हम आसानी के साथ जो आसानी से उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी, आमतौर पर निश्चित नमूना इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, भी समय चूक इमेजिंग प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए खुले स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है प्रदर्शित करता है.

Protocol

कृमि तैयार

  1. उपयुक्त 18-24hrs प्लेटें L4 लार्वा कीड़े 22 इमेजिंग पहले स्थानांतरण. इससे यह सुनिश्चित होगा आप जल्दी भ्रूण के एक पर्याप्त आपूर्ति के लिए अंडे असर वयस्कों है.
  2. वेसिलीन और agarose की ट्यूब तैयार. हम माइक्रोवेव में एक बीकर में वेसिलीन पिघलने और ट्यूब प्रति 4-5 एमएल विभाज्य में वितरण करके कई 15ml बाज़ ट्यूबों तैयार करते हैं. इसी तरह 2-3% (w / v) बफर में agarose (M9 या अंडा बफर) और विभाज्य बाज़ ट्यूबों में 4-5 एमएल पिघला. अधिक नहीं फोड़ा आदेश में वाष्पीकरण कम से कम करने के लिए सावधान रहें. इमेजिंग के दिन पर, एक 65-70 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में वेसिलीन की एक ट्यूब पिघल और agarose की एक ट्यूब माइक्रोवेव में पिघला करने के लिए, फिर पर उबलते को कम करने के लिए सावधान हो. गर्मी ब्लॉक में ट्यूबों को स्टोर करने के लिए पिघला हुआ राज्य में वेसिलीन और agarose रखने के लिए.
  3. Agarose पैड बनाओ. स्थिति 2 पुस्तिका स्लाइड्स के बीच एक नई माइक्रोस्कोपी स्लाइड है, जो आम प्रयोगशाला टेप की एक परत है और प्रत्येक गाइड स्लाइड के ऊपर और नीचे का पालन द्वारा कवर स्लाइड्स कर रहे हैं. नई स्लाइड पर पिघला agarose के 2-3 बूँदें जगह टूट अंत के साथ एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें. एक 2 एन डी मूल स्लाइड स्लाइड करने के लिए सीधा के साथ कवर इतना है, कि यह कवर और agarose प्रसार के लिए एक पतली वर्ग पैड बनाने में मदद करता है. 2 एन डी स्लाइड टेप के ऊपर गाइड स्लाइड पर आराम करना चाहिए . Agarose एकाग्रता मोटा पैड के लिए 5% की वृद्धि हुई किया जा सकता है.
  4. एक विदारक गुंजाइश है और एक प्लैटिनम तार का उपयोग लेने के लिए ', एक 18 मिमी x 18 मिमी coverslip पर एक 9-M9 या अंडा बफर के 12μL ड्रॉप करने के लिए स्थानांतरण 2 वयस्क कीड़े.
  5. कट कीड़े (हम 27G1 / 2 सुइयों का उपयोग) सुई या भ्रूण रिहाई स्केलपेल के साथ खुला. कृमि के बीच में कटौती करने की कोशिश करो.
  6. 18x18 मिमी भ्रूण युक्त coverslip पर agarose पैड (अगर नीचे की ओर के साथ) कम है. छाँटो अगर एक धार के साथ कवर पर्ची के किनारे से विस्तार.
  7. एक तूलिका या पतली लकड़ी की छड़ी coverslip के सभी चार किनारों को पिघला वेसिलीन लागू का उपयोग करके सील Coverslip.

अगर mounts वैकल्पिक हैं फांसी 23 बूँदें अगर भ्रूण दबाव के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं (यानी अगर अंडा खोल ठीक से फार्म नहीं करता है). इमेजिंग utero में भी किया जा सकता है निषेचन या अर्धसूत्रीविभाजन जैसे जल्दी घटनाओं का पालन . कीड़े 24 Levamisole साथ anesthetized होना चाहिए. आदेश में विकास की एक विशेष मंच से भ्रूण की संख्या में वृद्धि करने के लिए, कई कीड़े एक समय और एक साथ तैनात भ्रूण धीरे एक विंदुक - ठीक टिप या एक बरौनी ब्रश का उपयोग कर या मुंह pipetting द्वारा dissected किया जा सकता है.

4D Nomarski (विभेदकों हस्तक्षेप कंट्रास्ट) डीआईसी सिनेमा

  1. ओलिंप BX61 खुर्दबीन पर मुड़ें. क्योंकि कैमरा EM अन्य उपकरणों के द्वारा उत्सर्जित तरंगों के प्रति संवेदनशील है यह पिछले, पारा बल्ब (अगर GFP या प्रतिदीप्ति के लिए आवश्यक) के पहले चालू है. लघु मैनेजर प्रारंभ एक बार सब कुछ है. डीआईसी या फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए उपयुक्त विन्यास फाइल चुनें. मुख्य अंतर यह है कि डीआईसी फ़ाइल फ्लोरोसेंट शटर के नियंत्रण को शामिल नहीं करता है. प्रत्येक फ़ाइल भी उचित फिल्टर क्यूब और कैमरे के लाभ सेटिंग का चयन करता है.
  2. 10x उद्देश्य का उपयोग कर खुर्दबीन पर भ्रूण का पता लगाएं. युवा भ्रूण के समूहों के लिए कीड़ा शरीर के निकट देखो क्रम में इमेजिंग के क्षेत्र के भीतर कई भ्रूण मिल. सबसे अच्छा चित्र के लिए कीड़ा अंदर भ्रूण से बचें.
  3. सॉफ्टवेयर स्विच का उपयोग एक उच्च (100x करने के लिए 40x) बढ़ाई और संकल्प इमेजिंग (1.4 करने के लिए 0,9 एनए) के लिए उद्देश्य.
  4. ; Nomarski डीआईसी प्रकाशिकी (निम्न वेब साइटों डीआईसी प्रकाशिकी के उपयोगी विवरण और शब्दावली होते समायोजित http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
    1. हमारे ओलिंप BX61 में महत्वपूर्ण घटक हैं:
      1. Polarizer - संघनित्र नीचे स्लाइडर
      2. संघनित्र पर बुर्ज मंच के ठीक नीचे, कंडेनसर Wollaston चश्मे.
      3. उद्देश्य Wollaston चश्मे - फिल्टर cubes के नीचे स्लाइडर
      4. 2 एन डी (विश्लेषक) Polarizer - डीआईसी स्थिति में फिल्टर क्यूब
    2. डीआईसी फ़िल्टर घन स्विच करने के लिए प्रकाश पथ (सॉफ्टवेयर शुरू करने पर यह करना चाहिए) में विश्लेषक (2 एन डी polarizer) की स्थिति .
    3. यकीन है कि दो polarizers ठीक से जुड़ रहे हैं (पार कर). जब दोनों Wollaston prisms प्रकाश पथ से बाहर हैं देखने के क्षेत्र अंधेरा होना चाहिए. यदि आवश्यक हो, कंडेनसर नीचे polarizer बारी बारी से जब तक यह सही है.
    4. प्रकाश पथ में उद्देश्य (ऊपरी) Wollaston चश्मे डालें.
    5. संघनित्र पर बुर्ज घुमाएँ Wollaston चश्मे है कि आप उपयोग कर रहे हैं उद्देश्य मैचों का चयन करें.
    6. इस बुर्ज के नीचे स्लाइडर को समायोजित लेंस के एनए मैच.
    7. इष्टतम Koehler रोशनी के लिए संघनित्र फोकस.
    8. ऊपरी Wollaston प्राथमिक समायोजितएस.एम. स्लाइडर पर घुंडी rotating द्वारा इष्टतम विपरीत पाने के लिए.
    9. अन्य सॉफ्टवेयर स्टार्टअप द्वारा नियंत्रित सेटिंग्स कैमरा लाभ (0 करने के लिए सेट) और 8 बिट झगड़ा नहीं फ़ाइलें 16 बिट के रूप में सहेजने पर स्विच करने के शामिल हैं.
  5. प्रकाश के स्तर को समायोजित करने के लिए अच्छी छवि दे है. (आमतौर पर 4.7 वोल्ट का उपयोग करें) (सॉफ्टवेयर के माध्यम से नियंत्रित). हम नमूना रोशन ताकि प्रतिभाशाली पिक्सल संतृप्ति स्तर से नीचे हैं पसंद करते हैं.
    3 आयामी एक नज़र है जहां भ्रूण में जर्दी granules स्पष्ट रूप से बाहर खड़े के साथ एक छवि में अच्छा डीआईसी प्रकाशिकी परिणाम. वैकल्पिक रूप से इस रूप में अगर नमूना रोशन प्रकाश के एक कोण से चमक इतना है कि नमूने के एक पक्ष (या नमूने में सुविधाओं) चमकते जलाया है और विपरीत पक्ष छाया में है और गहरा दिखाई देता है प्रकट होता है में वर्णित किया जा सकता है.
  6. भ्रूण आप छवि के लिए चाहते हैं को शामिल करने के लिए ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का चयन करें, आरओआई बटन स्थापित करने के लिए खिड़की कम क्लिक करें.
  7. बहु - आयामी अधिग्रहण विंडो खोलें. (स्लाइसें) Z - ढेर और समय बिंदु का चयन करें.
  8. खुर्दबीन ध्यान केंद्रित घुंडी का उपयोग भ्रूण के नीचे (ध्यान में कुछ जर्दी granules के साथ पिछले फोकल हवाई जहाज़) मिल. तल पर चुनें क्लिक करें. की पहचान और भ्रूण के ऊपर सेट दोहराएँ. हम आम तौर पर 1 माइक्रोन कदम आकार का उपयोग करें और ~ 20 फोकल विमानों के साथ अंत. हम आम तौर पर हर समय बिंदु पर कई फोकल विमानों इकट्ठा क्योंकि भ्रूण कोशिकाओं और अपेक्षाकृत मोटी हैं. इसके अलावा, खासकर जब कोशिकाओं को अलग झुकाव में विभाजित शुरू वे अन्य कोशिकाओं के आसपास भ्रूण में कर सकते हैं विस्थापित उन्हें मूल फोकल हवाई जहाज़ के अंदर या बाहर चलती हैं. यदि आपके खुर्दबीन ध्यान केंद्रित के मोटर नहीं है आप मैन्युअल ध्यान समायोजित करने के लिए आप रुचि रखते हैं कक्ष या प्रक्रिया का पालन कर सकते हैं.
  9. समय अंक और समय अंतराल के इनपुट संख्या की जरूरत है. हम आम तौर पर 15 सेकंड के अंतराल का उपयोग करें और 500 समय अंक की एक अधिकतम सेट है. हम अधिक समय अंक के साथ शुरू की तुलना में हम की जरूरत है और अधिग्रहण रोक देंगे जब वांछित. यदि आप इमेजिंग एकाधिक फोकल विमानों कर रहे हैं, सुनिश्चित करें कि वहाँ पर्याप्त समय सभी समय अंक के बीच के अंतराल में केन्द्र विमानों के अधिग्रहण के लिए है.
  10. का चयन करें या एक स्थान बनाने के लिए डेटा को बचाने. यकीन है कि सॉफ्टवेयर केवल पिछले छवि प्रदर्शित करने के लिए सेट कर दिया जाता है. फ़ाइल को कोई नाम दें और मोल क्लिक करें. पहले कुछ समय के अंक के लिए स्वचालित छवि अधिग्रहण मॉनिटर करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह ठीक से काम कर रहा है.
  11. बंद करो जब तुम अधिग्रहण बंद करना चाहते हैं क्लिक करें, 10x उद्देश्य के लिए स्विच और अगली स्लाइड तैयार हैं.
  12. जब किया इमेजिंग प्रकाश पथ से डीआईसी घटकों को दूर. यदि आवश्यक उद्देश्य बंद साफ़ तेल. कैमरे के साथ शुरू से सब कुछ चालू.

GFP सिनेमा

  1. प्रारंभ खुर्दबीन और भ्रूण के रूप में खोजने के लिए उपरोक्त. का प्रयोग करें विन्यास फाइल है कि फ्लोरोसेंट शटर के सॉफ्टवेयर नियंत्रण शामिल.
  2. सुनिश्चित करें कि ऊपरी डीआईसी चश्मे (स्लाइडर) प्रकाश पथ में नहीं है.
  3. FITC / GFP के लिए फ़िल्टर घन (स्टार्टअप पर स्वचालित रूप से सेट) स्विच
  4. 16 बिट झगड़ा (इस विन्यास फाइल के साथ स्टार्टअप पर स्वचालित रूप से सेट) कैमरा 255 लाभ और छवि फ़ाइल बदलें.
  5. श्वेत प्रकाश बंद करें.
  6. इमेजिंग लाइव पूर्वावलोकन छवि क्लिक करें. प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए जल्दी से काम. वैकल्पिक रूप से स्नैप छवि का उपयोग करने के लिए एकल छवि एकत्र.
  7. मर्करी बल्ब शक्ति / तटस्थ घनत्व फिल्टर, प्रदर्शन करने के लिए एक अच्छी छवि को पाने लंबाई समायोजित करें. सामान्य में, आप न्यूनतम नमूना तक पहुँचने के लिए आप सेल और प्रतिदीप्ति संकेतों के photobleaching photodamage कम करना चाहते हैं डेटा प्राप्त प्रकाश का उपयोग करना चाहिए.
  8. समय अंतराल, समय बिंदुओं की संख्या और फोकल विमानों की संख्या निर्धारित करें. हम अक्सर 5-10 सेकंड के अंतराल और 1-3 फोकल हवाई जहाज़ का उपयोग करें.
  9. आरओआई का चयन करें और छवि अधिग्रहण के लिए मानकों सेट के रूप में 13-19 चरणों में पहले वर्णित है.

विश्लेषण सिनेमा

  1. डेटा आपके द्वारा दर्ज नाम के साथ फ़ोल्डर में और 4D ढेर के प्रत्येक छवि के लिए झगड़ा फ़ाइलों की एक श्रृंखला, एक पाठ फ़ाइल और एक xml फ़ाइल युक्त मेटाडेटा जोखिम के स्तर को और समय अंतराल जैसे होते हैं बचाया जाएगा.
  2. झगड़ा छवियाँ ImageJ द्वारा दो विधियों के माध्यम से खोला जा सकता है. पहली (विधि एक) सरल है और भी प्रत्येक फ़ाइल के मेटाडाटा को पढ़ा होगा. दूसरा (विधि ख) करने के लिए वर्चुअल स्मृति का उपयोग करें ImageJ के लिए आबंटित स्मृति की मात्रा से बड़ा फ़ाइलें खोलने में सक्षम है, लेकिन यह मेटाडाटा को शामिल नहीं करता है.
    1. माइक्रो - प्रबंधक प्लगइन का उपयोग करना
      1. माइक्रो प्रबंधक बनाया गया है और उपयोग करता है (यह ImageJ का एक नया संस्करण है जो किसी भी दूसरे संस्करण है कि आप पहले से स्थापित हो सकता है से अलग हो जाएगा स्थापित) ImageJ और एक प्लगइन के लिए डेटा को खोलने के शामिल है. वैकल्पिक रूप से आप ImageJ के दूसरे संस्करण के लिए Micro-Manager-1.3/plugins फ़ोल्डर की सामग्री plugins के फ़ोल्डर को कॉपी कर सकते हैं.
      2. Plugins मेनू पर जाएँ, माइक्रो प्रबंधक का चयन करें और तब खोलें माइक्रो - प्रबंधक फ़ाइल.
      3. फ़ोल्डर का चयन करें जिसमें आप डेटा देखने के लिए और ठीक क्लिक करें करना चाहते हैं.
      4. जेड और टी आयामों के माध्यम से खेलो.
    2. Loci plugi का उपयोगBioFormats आयातक के साथ फिल्मों को खोलने के n है.
      1. झगड़ा फ़ाइलों को युक्त फ़ोल्डर से xml और txt फ़ाइलें स्थानांतरण, और दो फ़ाइलों का नाम बदलने के लिए डेटा सेट का नाम मैच.
      2. ImageJ भीतर प्लगइन्स के लिए डाउन मेनू पुल, loci का चयन करें और तब या तो डेटा ब्राउज़र या जैव स्वरूप आयातक.
      3. अपनी झगड़ा ढेर के साथ फ़ोल्डर का पता लगाएं. पहले झगड़ा फ़ाइल पर क्लिक करें, तो खोलने के लिए.
      4. Hyperstack साथ ढेर देखें. Dataset संगठन के तहत: इसी तरह के नाम, स्वैप के आयामों के साथ समूह फ़ाइलें का चयन करें और सभी श्रृंखला खोलें. मेमोरी प्रबंधन के तहत: चुनें: आभासी ढेर (विशेष रूप से बड़े डेटा सेट के लिए) का प्रयोग करें. ठीक पर क्लिक करें
      5. प्लगइन डेटा सेट के आयाम (# समय अंक और फोकल विमानों के) <> कोष्ठक के एक सेट के बीच सीमा निर्धारण और प्रदर्शित करेगा. ठीक पर क्लिक करें या समय अंक और / या फोकल विमानों को खोलने की संख्या को बदल.
      6. पुष्टि करें जो आयाम प्रत्येक श्रृंखला के लिए मेल खाती है.
      7. जेड और टी आयामों के माध्यम से खेलो.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
एक Nomarski डीआईसी फिल्म से चित्रा 1 पोस्टरों जल्दी सी. के दौरान सामान्य सेलुलर घटनाओं illustrating एलिगेंस भ्रूण विकास: pronuclear प्रवास (0-5:45), असममित प्रथम श्रेणी (6:45-14:45) और अतुल्यकालिक दूसरे विभाजन (14:45-27:00). डेटा एक 60x 1.35 एनए लेंस के साथ एकत्र की गई थी. 1 माइक्रोन अंतराल पर 20 फोकल विमानों 40 μs के जोखिम के साथ हर 15 सेकंड में एकत्र किए गए थे. छवियाँ घुमाया गया ताकि पीछे सही और उदर नीचे है. स्केलपट्टी 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 2
चित्रा 2 एक फ्लोरोसेंट गुणसूत्र यात्री परिसर के एक सबयूनिट GFP लेबल (आकाशवाणी-2) गुणसूत्रों पर मेटाफ़ेज़ से जल्दी anaphase (सी) anaphase में धुरा midzone पर प्रदर्शित होने से पहले तक मौजूद गतिशील आंदोलनों illustrating फिल्म से चित्र. cytokinesis पूर्ण कर लेता है (एफ सी). डेटा एक 60x 1.35 एनए लेंस के साथ एकत्र की गई थी. एक एकल नाभीय विमान 50 μsec जोखिम के साथ हर 10 सेकंड एकत्र किया गया था. छवियाँ घुमाया गया ताकि पीछे सही करने के लिए है. स्केलपट्टी 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं.

मूवी एक जंगली - प्रकार भ्रूण के Nomarski मूवी.
इसी मूवी चित्रा 1. पोस्टीरियर सही और उदर नीचे है निचले बाएँ है. मूल डेटा सेट की एक एकल नाभीय विमान दिखाता है. छवि हर 15 सेकंड में एकत्र किया गया था और वापस खेलने प्रति सेकंड 14 तख्ते पर सेट कर दिया जाता है . यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

जंगली प्रकार GFP व्यक्त भ्रूण की मूवी 2 प्रतिदीप्त मूवी:: आकाशवाणी-2.
चित्रा 2 करने के लिए इसी मूवी. पोस्टीरियर ऊपरी दाएँ है. मूवी एक एकल नाभीय विमान के रूप में एकत्र किया गया था. छवि हर 10 सेकंड एकत्र किया गया था और वापस खेलने प्रति सेकंड 14 तख्ते पर सेट कर दिया जाता है. यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

Discussion

रहते इमेजिंग समय चूक के लिए एक प्रमुख विचार अखंडता और सेल और जीव की व्यवहार्यता की रक्षा है. डीआईसी माइक्रोस्कोपी लाभ है कि नमूना पराबैंगनी प्रकाश और प्रकाश स्रोत से अत्यधिक हीटिंग के संपर्क में नहीं है प्रदान करता है. डीआईसी माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह से करने के लिए सेल प्रवास और सेल cytokinesis जैसे आकार में परिवर्तन का पता लगाने और mitotic धुरा और परमाणु झिल्ली के रूप में कुछ subcellular संरचनाओं, की पहचान करने के लिए अनुकूल है. संवाददाता प्रोटीन की प्रतिदीप्ति इमेजिंग अतिरिक्त subcellular डिब्बों की पहचान और विशिष्ट प्रोटीन के दृश्य की अनुमति डीआईसी माइक्रोस्कोपी पूरक. Phototoxicity और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान भ्रूण को नुकसान के खतरों को कम करने के लिए, हम आम तौर पर डिजिटल कैमरे के लाभ को बढ़ाने के लिए कम यूवी प्रकाश तीव्रता और रोशनी की अवधि ऑफसेट. बेहोश फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक संवाददाताओं के लिए deconvolution एल्गोरिदम बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश या deblurring एल्गोरिदम पुन: असाइन करने के लिए कम पृष्ठभूमि कब्जा कर लिया छवियों की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं. जबकि confocal या multiphoton सिस्टम जैसे उन्नत सूक्ष्मदर्शी कभी कभी आवश्यक हैं, हमने पाया है कि कई फ्लोरोसेंट संवाददाताओं इस epifluorescent खुर्दबीन सेटअप का उपयोग कर, उच्च गुणवत्ता छवियों उपज imaged किया जा सकता है.

माइक्रो प्रबंधक (http://www.micro-manager.org), मुक्त होने के अलावा, सीधे झगड़ा प्रारूप फ़ाइलों के बजाय कई वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर संकुल के मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों बचाता है. यह महत्वपूर्ण फ़ाइल रूपांतरण ImageJ, Photoshop और अन्य छवि संपादन सॉफ्टवेयर में छवि फ़ाइलों को पढ़ने के लिए आवश्यक कदम को नष्ट करने से हमारे डेटा का विश्लेषण सरल है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

आंतरिक संस्थागत धन और मिशिगन विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विद्वान कार्यक्रम इस काम का समर्थन किया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses Olympus Corporation
Micro-Manager 1.3.46 Micro-Manager http://www.micro-manager.org
Image J 1.43 http://rsbweb.nih.gov/ij
loci_tools.jar http://www.loci.wisc.edu
Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Laboratory tape Fisher Scientific 15-901
18 mm x 18 mm #1.5 coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
  2. Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
  3. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
  4. Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. 1-40 (2006).
  5. Heuvel, S. vanden Cell-cycle regulation. WormBook. 1-16 (2005).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. 1-22 (2005).
  7. Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. 1-20 (2005).
  8. Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. 1-13 (2005).
  9. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. 1-16 (2005).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  11. O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
  12. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
  13. Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
  14. Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
  15. Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
  16. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  17. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  18. Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
  19. Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
  20. Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
  21. Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11 (2006).
  23. Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
  24. Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
  25. Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. 1-15 (2006).
इमेजिंग<em> सी. एलिगेंस</em> एक Epifluorescent माइक्रोस्कोप और ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग भ्रूण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. J. Vis. Exp. (49), e2625, doi:10.3791/2625 (2011).More

Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. J. Vis. Exp. (49), e2625, doi:10.3791/2625 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter