<em> सी. एलिगेंस</em> भ्रूण विकास और कोशिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है. हम के रहते इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान<em> सी. एलिगेंस</em> भ्रूण डीआईसी प्रकाशिकी या प्रतिदीप्ति आसानी से उपलब्ध epifluorescent सूक्ष्मदर्शी और खुले स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर का उपयोग.
गुणसूत्र विधानसभा अलगाव, और cytokinesis जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं, स्वाभाविक गतिशील हैं. जीवित कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग, फ्लोरोसेंट लेबल संवाददाता प्रोटीन या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग, जो अन्यथा तय नमूने 1,2 के विश्लेषण से inferred है इन गतिशील घटनाओं के अस्थायी प्रगति की परीक्षा के लिए अनुमति देता है . इसके अलावा, सेलुलर प्रक्रियाओं के विकास के नियमों के अध्ययन के विकास के दौरान एक अक्षुण्ण जीव पर समय चूक प्रयोगों का आयोजन आवश्यक. Caenorhabiditis एलिगेंस भ्रूण प्रकाश पारदर्शी है और एक तेजी से, 3 वंश एक ज्ञात सेल के साथ अपरिवर्तनीय विकासात्मक कार्यक्रम है, इस प्रकार सेल 4,5 और 6-9 विकास जीव विज्ञान में सवालों का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श प्रयोग मॉडल प्रदान सी.. एलिगेंस आगे आनुवंशिकी (यादृच्छिक mutagenesis के 10,11 पर आधारित) और रिवर्स करने के लिए विशिष्ट जीन को लक्षित आनुवंशिकी (आरएनएआई की मध्यस्थता हस्तक्षेप के आधार पर और लक्षित 12-15 mutagenesis के) द्वारा आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए शोधने योग्य है . इसके अलावा, ट्रांसजेनिक जानवर आसानी से हो fluorescently टैग प्रोटीन संवाददाताओं से या 16,17 व्यक्त बनाया जा सकता. ये लक्षण आनुवंशिक 18-21 vivo में मौलिक सेलुलर और विकास की प्रक्रिया का विनियमन रास्ते की पहचान करने के लिए इसे आसान बनाने के लिए गठबंधन. इस प्रोटोकॉल में हम रहते इमेजिंग के लिए सी. के तरीकों वर्तमान एलिगेंस एक यौगिक epifluorescent खुर्दबीन पर डीआईसी प्रकाशिकी या GFP प्रतिदीप्ति का उपयोग भ्रूण . हम आसानी के साथ जो आसानी से उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी, आमतौर पर निश्चित नमूना इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है, भी समय चूक इमेजिंग प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए खुले स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है प्रदर्शित करता है.
रहते इमेजिंग समय चूक के लिए एक प्रमुख विचार अखंडता और सेल और जीव की व्यवहार्यता की रक्षा है. डीआईसी माइक्रोस्कोपी लाभ है कि नमूना पराबैंगनी प्रकाश और प्रकाश स्रोत से अत्यधिक हीटिंग के संपर्क में नहीं है प्रदान करता है. डीआईसी माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह से करने के लिए सेल प्रवास और सेल cytokinesis जैसे आकार में परिवर्तन का पता लगाने और mitotic धुरा और परमाणु झिल्ली के रूप में कुछ subcellular संरचनाओं, की पहचान करने के लिए अनुकूल है. संवाददाता प्रोटीन की प्रतिदीप्ति इमेजिंग अतिरिक्त subcellular डिब्बों की पहचान और विशिष्ट प्रोटीन के दृश्य की अनुमति डीआईसी माइक्रोस्कोपी पूरक. Phototoxicity और प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान भ्रूण को नुकसान के खतरों को कम करने के लिए, हम आम तौर पर डिजिटल कैमरे के लाभ को बढ़ाने के लिए कम यूवी प्रकाश तीव्रता और रोशनी की अवधि ऑफसेट. बेहोश फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक संवाददाताओं के लिए deconvolution एल्गोरिदम बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश या deblurring एल्गोरिदम पुन: असाइन करने के लिए कम पृष्ठभूमि कब्जा कर लिया छवियों की गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं. जबकि confocal या multiphoton सिस्टम जैसे उन्नत सूक्ष्मदर्शी कभी कभी आवश्यक हैं, हमने पाया है कि कई फ्लोरोसेंट संवाददाताओं इस epifluorescent खुर्दबीन सेटअप का उपयोग कर, उच्च गुणवत्ता छवियों उपज imaged किया जा सकता है.
माइक्रो प्रबंधक (http://www.micro-manager.org), मुक्त होने के अलावा, सीधे झगड़ा प्रारूप फ़ाइलों के बजाय कई वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर संकुल के मालिकाना फ़ाइल स्वरूपों बचाता है. यह महत्वपूर्ण फ़ाइल रूपांतरण ImageJ, Photoshop और अन्य छवि संपादन सॉफ्टवेयर में छवि फ़ाइलों को पढ़ने के लिए आवश्यक कदम को नष्ट करने से हमारे डेटा का विश्लेषण सरल है.
The authors have nothing to disclose.
आंतरिक संस्थागत धन और मिशिगन विश्वविद्यालय में जीव विज्ञान विद्वान कार्यक्रम इस काम का समर्थन किया.
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses
Micro-Manager 1.3.46(http://www.micro-manager.org)
Image J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij)
loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu)
Agarose – molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides (Catalog # 12-550-15)
Laboratory tape (Fisher Catalog # 15-901 Series)
18 mm x 18 mm #1.5 Coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) or a scalpel with a small blade