Summary
O
Abstract
Processos celulares, como a segregação de cromossomos, montagem e citocinese, são inerentemente dinâmicos. Lapso de tempo de imagens de células vivas, utilizando-fluorescente etiquetado proteínas repórter ou contraste de interferência diferencial (DIC) de microscopia, permite a análise da progressão temporal destes eventos dinâmicos que de outra forma inferida a partir de análise de amostras de 1,2 fixo. Além disso, o estudo dos regulamentos de desenvolvimento de processos celulares requer a realização de experimentos de lapso de tempo em um organismo intacto durante o desenvolvimento. O embrião Caenorhabiditis elegans é luz transparente e tem uma resposta rápida, programa de desenvolvimento invariante com uma célula conhecida linhagem 3, proporcionando assim uma experiência modelo ideal para estudar questões na biologia de células 4,5 e desenvolvimento 6-9. C. elegans pode ser alterada para a manipulação genética pela frente genética (mutagênese aleatória com base em 10,11) e da genética reversa para genes-alvo específicos (baseados em RNAi interferência mediada e orientada mutagênese 12-15). Além disso, animais transgênicos podem ser facilmente criado para expressar as proteínas fluorescentes marcados ou repórteres 16,17. Essas características se combinam para tornar mais fácil identificar as vias genéticas que regulam processos celulares fundamentais e de desenvolvimento in vivo 18-21. Neste protocolo, apresentamos métodos para geração de imagens ao vivo de C. embriões elegans utilizando óptica DIC ou de fluorescência da GFP em um microscópio composto de epifluorescência. Nós demonstramos a facilidade com que os microscópios prontamente disponíveis, normalmente usado para imagens de amostra fixa, também pode ser aplicado para o lapso de tempo de análise usando open-source software para automatizar o processo de imagem.
Protocol
Preparação Worm
- Transferência L4 worms larval de placas apropriadas 18-24hs antes da imagem 22. Isso irá garantir que você tenha ovo-rolamento adultos para uma ampla oferta de embriões.
- Prepare os tubos de vaselina e Agarose. Nós preparamos vários tubos de 15mL falcon pelo derretimento vaselina num copo no microondas e dispensa em 05/04 alíquota mL por tubo. Da mesma forma derreter 2-3% (w / v) em tampão de Agarose (M9 ou Egg buffer) e 4-5 mL alíquota em tubos falcon. Tenha cuidado para não ferver em excesso, a fim de minimizar a evaporação. No dia da imagem, derreta um tubo de vaselina em um bloco de aquecimento 65-70 ° C e derreter um tubo de agarose no microondas, mais uma vez ter cuidado para minimizar a ferver sobre. Armazenar os tubos no bloco de calor para manter a vaselina e os Agarose no estado fundido.
- Faça Agarose pad. Posição uma lâmina de microscopia novo entre dois slides guia, que são cobertos por lâminas de uma única camada de fita de laboratório comum adere a parte superior e inferior de cada slide guia. Use uma pipeta Pasteur com ponta quebrada para colocar 2-3 gotas de agarose derretida no novo slide. Cubra com um slide 2 nd perpendicular ao slide original, para que ela cobre e ajuda a espalhar a Agarose para criar uma almofada fina quadrados. O slide 2 º deve descansar acima da fita nos slides guia. A concentração de Agarose pode ser aumentada para 5% para almofadas mais espessas.
- Usando um escopo de dissecação e um fio de platina "pick", a transferência de dois vermes adultos a uma queda de 9 12μL de tampão M9 ou ovo em uma lamela mm x 18 mm 18.
- Corte worms aberta com uma agulha (usamos 27G1 / 2 agulhas) ou bisturi para liberar embriões. Tente cortar no meio do worm.
- Menor Agarose pad (com o lado agar para baixo) para a lamela 18x18 milímetros contendo os embriões. Agar guarnição que se estende desde a borda da lamínula com uma lâmina de barbear.
- Seal Coverslip usando um pincel ou vara de madeira fina para aplicar a vaselina derretida para todas as quatro bordas da lamínula.
Alternativa para montagens agar estão pendurados cai 23 se os embriões são suscetíveis à pressão (ou seja, se a casca do ovo não faz corretamente). Imagem também pode ser realizada dentro do útero a seguir fertilização ou eventos precoces, como a meiose. Worms devem ser anestesiados com Levamisole 24. A fim de aumentar o número de embriões a partir de um determinado estágio de desenvolvimento, worms várias pode ser dissecado em um tempo e os embriões posicionadas juntas delicadamente usando uma ponta fina-pipeta ou uma escova de cílios ou pipetar à boca.
4D Nomarski DIC (contraste de interferência diferencial) Filmes
- Ligue o microscópio BX61 Olympus. Como a câmera é sensível a EM ondas emitidas por outros dispositivos que está ligado passado, a lâmpada de mercúrio (se necessário, para GFP ou fluorescência) em primeiro lugar. Iniciar Micro Manager-uma vez que tudo está ligado. Escolha o arquivo de configuração adequada para imagem DIC ou fluorescentes. A principal diferença é que o arquivo DIC não inclui controle de obturador fluorescente. Cada arquivo também seleciona o cubo de filtro apropriado e ajuste de ganho da câmera.
- Encontrar embriões no microscópio utilizando objetiva de 10x. Procure perto de corpos sem-fim para os grupos de embriões jovens a fim de obter vários embriões dentro do campo de imagem. Evite embriões dentro do worm para melhores imagens.
- Utilizando o interruptor de software para uma maior ampliação (40x a 100x) e resolução (NA 0,9-1,4) O objectivo para a imagem latente.
- Ajuste Nomarski DIC Optics (Os seguintes sites contêm explicação útil da óptica DIC ea terminologia; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)- Em nosso Olympus BX61 os componentes importantes são:
- Polarizador - controle deslizante abaixo do condensador
- Prism condensador Wollaston - torre no condensador, logo abaixo do palco.
- Prism Wollaston objetivo - controle deslizante abaixo do filtro de cubos
- 2 nd polarizador (analisador) - cubo de filtro na posição DIC
- Interruptor Cube Filtro para DIC para posicionar o Analyzer (2 polarizador nd) no caminho da luz (software deve fazer isso no arranque).
- Certifique-se que os dois polarizadores estão devidamente alinhados (cruzados). Quando ambos os prismas Wollaston estão fora do caminho da luz do campo de visão deve ser escura. Se necessário, gire o polarizador abaixo do condensador até que isso seja correto.
- Insira o objetivo (superior) Prism Wollaston no caminho da luz.
- Gire o revólver no condensador para selecionar o prisma Wollaston que corresponde ao objetivo que você está usando.
- Ajuste o controle deslizante abaixo desta torre para combinar NA da lente.
- Foco do condensador para a iluminação Koehler ideal.
- Ajustar o superior Wollaston Prism para obter um contraste ideal, girando o botão do controle deslizante.
- Outras configurações de inicialização controladas por software incluem o ganho de câmera (definido como 0) e mudar para salvar arquivos como 8-bit não arquivos TIFF de 16 bits.
- Em nosso Olympus BX61 os componentes importantes são:
- Ajustar o nível de luz para dar boa imagem. (Geralmente usam 4,7 Volts) (controlada via software). Nós preferimos a iluminar a amostra de modo que o mais brilhante pixels são apenas abaixo dos níveis de saturação.
Bom DIC resultados óptica em uma imagem com um olhar 3-dimensional, onde os grânulos da gema no embrião destacam-se claramente. Em alternativa, este pode ser descrito como se a luz que ilumina a amostra aparece para brilhar a partir de um ângulo de modo que um lado da amostra (ou características da amostra) é iluminado brilhantemente e do lado oposto está nas sombras e aparece mais escura. - Selecione região de interesse (ROI) para incluir os embriões que você quer para a imagem, clique em conjunto de botões ROI para reduzir janela.
- Abrir a janela de aquisição multi-dimensional. Selecione Z-stacks (fatias) e Pontos de Time.
- Use botão de foco microscópio para encontrar o fundo do embrião (plano focal passado, com alguns grânulos da gema em foco). Clique em baixo Select. Repita o procedimento para identificar e definir o topo do embrião. Normalmente, usamos um tamanho do passo micron e acabar com ~ 20 aviões focal. Em geral, coletar vários planos focais em cada momento, porque os embriões e células são relativamente grosso. Além disso, especialmente quando as células começam a se dividir em diferentes orientações podem deslocar em torno de outras células no embrião movê-los dentro ou fora do plano focal original. Se o seu microscópio não tem um motor de foco você pode ajustar manualmente o foco para seguir o processo de celular ou você está interessado.
- Número de entrada de pontos de tempo e intervalo de tempo necessário. Nós usamos geralmente intervalo de 15 segundos ea um máximo de 500 pontos tempo. Começamos com pontos mais tempo do que vamos precisar parar a aquisição e quando desejar. Se você é imagem múltiplos planos focais, certifique-se que há tempo suficiente para adquirir todos os planos focais no intervalo entre os pontos de tempo.
- Selecionar ou criar um local para salvar os dados. Certifique-se que o software é configurado para exibir a última imagem só. Dê um nome ao arquivo e clique em Acquire. Monitorar a aquisição de imagem automatizado para os primeiros pontos pouco tempo para garantir que ele está funcionando corretamente.
- Clique parar quando quiser parar a aquisição, mude para objetiva de 10x e preparar o próximo slide.
- Quando terminar de imagem remover componentes DIC do caminho da luz. Óleo limpo off objetivo se necessário. Desligue tudo começando com a câmera.
Filmes GFP
- Iniciar microscópio e encontrar embriões como acima. Use arquivo de configuração que inclui o controle de software do obturador fluorescente.
- Certifique-se que o prisma superior DIC (slider) não está no caminho de luz.
- Interruptor Cube filtro para FITC / GFP (definido automaticamente na inicialização)
- Alterar o ganho da câmera para 255 e arquivo de imagem para 16-bit Tiff (definido automaticamente na inicialização com esse arquivo de configuração).
- Desligue a luz branca.
- Clique ao vivo de imagens para visualização da imagem. Trabalhar rapidamente para minimizar a exposição à luz. Alternativamente use Imagem Snap para coletar única imagem.
- Ajuste Mercury poder bulbo / filtros de densidade neutra, comprimento exposição para obter uma boa imagem. Em geral, você deve usar luz atingindo o mínimo de amostra para obter os dados que pretende reduzir photodamage para a célula e fotodegradação dos sinais de fluorescência.
- Configurar intervalo de tempo, número de pontos de tempo e número de aviões focal. Muitas vezes usamos 10/05 intervalos de um segundo plano focal e 1-3.
- Selecione ROI e definir parâmetros para aquisição de imagem, como descrito anteriormente em Passos 13-19.
Filmes analisando
- Dados serão guardados para a pasta com o nome digitado e conter uma série de arquivos para cada imagem tiff da pilha 4D, um arquivo de texto e um arquivo xml contendo metadados, tais como níveis de exposição e intervalos de tempo.
- As imagens TIFF podem ser abertos por ImageJ através de dois métodos. O primeiro (um método) é o mais simples e também ler os metadados de cada arquivo. A segunda (método b) é capaz de usar a memória virtual para abrir arquivos que são maiores do que a quantidade de memória alocada para ImageJ, mas não inclui os metadados.
- Usando Micro-Manager Plugin
- Micro-Manager é construído sobre e usa ImageJ (ele instala uma nova versão do ImageJ que será diferente de qualquer outra versão que você pode ter instalado anteriormente) e inclui um plugin para abrir dados. Alternativamente, você pode copiar o conteúdo da pasta Micro-Manager-1.3/plugins para a pasta plugins para outra versão do ImageJ.
- Ir para o menu Plugins, selecione Micro-Manager e, em seguida, File Manager Micro-Open.
- Selecione a pasta que contém os dados que deseja visualizar e clique ok.
- Jogue através das dimensões Z e T.
- Usando LOCI plugin para abrir filmes com Importador BioFormats.
- Xml e transferir os arquivos txt da pasta contendo os arquivos de tiff e renomear os dois arquivos para corresponder ao nome do conjunto de dados.
- Dentro ImageJ, vá para o Plugins no menu suspenso, selecione LOCI e então ou Data Browser ou Bio-Formatos de importação.
- Encontre a pasta com as pilhas a sua tiff. Clique sobre o arquivo tiff em primeiro lugar, em seguida, abra.
- Ver pilha com Hyperstack. Sob organização Dataset: Selecione Arquivos de Grupo com dimensões Trocar nomes similares, e Abra todas as séries. Sob gestão da memória: Selecione: Use pilha virtual (especialmente para grandes conjuntos de dados). Clique ok
- O plugin irá determinar as dimensões do conjunto de dados (número de pontos no tempo e aviões focal) e exibir o intervalo entre um conjunto de <> colchetes. Clique em OK ou alterar o número de pontos no tempo e / ou planos focais para abrir.
- Confirmar que dimensão corresponde a cada série.
- Jogue através das dimensões Z e T.
- Usando Micro-Manager Plugin
Resultados representante
Figura 1. Stills de um filme ilustrando DIC Nomarski normais eventos celulares durante o início C. elegans desenvolvimento embrionário: migração pronuclear (0-5:45), primeira divisão assimétrica (6:45-14:45) e segunda divisão assíncrona (14:45-27:00). Os dados foram coletados com uma lente 60x NA 1,35. 20 aviões focal em intervalos de 1 micron foram coletados a cada 15 segundos de exposição com 40 mS. As imagens foram mudados de modo que é posterior à direita e ventral é baixo. Bar escala representam 10 microns.
Figura 2. Stills de um filme fluorescentes ilustrando os movimentos dinâmicos de uma subunidade GFP-rotulados do complexo de passageiros cromossomo (AR-2) presentes em cromossomos de metáfase anáfase de início (A a C) antes de aparecer na midzone fuso em anáfase até citocinese completa (C a F). Os dados foram coletados com uma lente 60x NA 1,35. Um único plano focal foi coletada a cada 10 segundos de exposição com 50 ms. As imagens foram mudados de modo que é posterior à direita. Bar escala representam 10 microns.
Filme 1 Filme Nomarski de Wild-Type Embryo.
Filme correspondente a Figura 1. Posterior é para a parte inferior direita e ventral é o inferior esquerdo. Mostra um único plano focal do conjunto de dados original. A imagem foi recolhida a cada 15 segundos e reproduzir é fixado em 14 quadros por segundo. Clique aqui para assistir vídeo
Filme Movie 2 fluorescentes de tipo selvagem embrião expressando GFP:: AIR-2.
Filme correspondente à Figura 2. Posterior é no canto superior direito. Filme foi coletado como um único plano focal. A imagem foi recolhida a cada 10 segundos e reproduzir é fixado em 14 quadros por segundo. Clique aqui para assistir vídeo
Discussion
Uma consideração importante para a imagem latente de lapso de tempo viver é preservar a integridade e viabilidade da célula e do organismo. Microscopia DIC fornece o benefício que a amostra não é exposto à luz ultravioleta e aquecimento excessivo da fonte de iluminação. Microscopia DIC é adequado para detectar a migração celular e alterações nas células forma como citocinese e identificar algumas estruturas subcelulares, como o fuso mitótico e membrana nuclear. Imagens de fluorescência de proteínas repórter complementa microscopia DIC, identificando adicionais compartimentos subcelulares e permitindo a visualização de proteínas específicas. Para mitigar os riscos de fototoxicidade e danos ao embrião durante a imagens de fluorescência, que geralmente aumentam o ganho digitais da câmera, para compensar a intensidade da luz UV e duração reduzida de iluminação. Para fraco fluorescentes repórteres transgênicos, algoritmos de deconvolução para reatribuir algoritmos fora de foco de luz ou deblurring reduzir o fundo pode melhorar a qualidade das imagens capturadas. Enquanto microscópios avançados, tais como sistemas confocal ou multifotônica às vezes são necessários, temos verificado que muitos repórteres fluorescentes podem ser visualizados usando esta configuração de microscópio de epifluorescência, produzindo imagens de alta qualidade.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), além de ser livre, salva os arquivos diretamente para o formato TIFF em vez de formatos de arquivos proprietários de muitos pacotes de software comercial. Este simplifica significativamente a análise de nossos dados, eliminando a etapa de conversão de arquivos necessários para ler os arquivos de imagem em ImageJ, Photoshop e software de edição de imagem.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Interna fundos institucionais e as Ciências Biológicas Scholars Program da Universidade de Michigan apoiaram este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
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