Summary
La
Abstract
Procesos celulares, como el cromosoma de la Asamblea, la segregación y la citocinesis, son inherentemente dinámico. Time-lapse de imágenes de células vivas, utilizando proteínas marcadas con fluorescencia reportero o el contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía, permite el examen de la evolución temporal de estos eventos dinámicos que se infiere de lo contrario el análisis de muestras de 1,2 fijo. Por otra parte, el estudio de las normas de desarrollo de los procesos celulares requiere la realización de experimentos con lapso de tiempo en un organismo intacto durante el desarrollo. El embrión Caenorhabiditis elegans es de color transparente y tiene un programa rápido, invariante en el desarrollo de una célula conocida linaje 3, proporcionando así un modelo de experimentación ideal para estudiar las cuestiones de la biología celular y desarrollo 4,5 9.6. C. elegans es modificable a la manipulación genética por delante la genética (sobre la base de mutagénesis aleatoria 10,11) y la genética inversa para apuntar genes específicos (basados en RNAi interferencia y dirigida mutagénesis 12-15). Además, los animales transgénicos pueden ser fácilmente creados para expresar las proteínas de marcado con fluorescencia o reporteros 16,17. Estas características se combinan para hacer que sea fácil de identificar los mecanismos genéticos que regulan los procesos celulares fundamentales y de desarrollo in vivo 18-21. En este protocolo se presentan los métodos para obtener imágenes en directo de C. elegans embriones utilizando la óptica DIC y fluorescencia de GFP en un microscopio de epifluorescencia compuesto. Se demuestra la facilidad con la que los microscopios disponibles, normalmente se utiliza para obtener imágenes de muestra fijo, también se puede aplicar para realizar un análisis cronológico utilizando software de código abierto para automatizar el proceso de imágenes.
Protocol
Gusano de preparación
- Transferencia L4 gusanos larvas en placas apropiadas de 18 24 horas antes de la imagen 22. Esto le asegura ovígeras adultos de una amplia oferta de embriones tempranos.
- Prepare los tubos de vaselina y agarosa. Preparamos varios tubos Falcon de 15 ml por la fusión de vaselina en un recipiente en el microondas y la distribución en alícuotas 4-5 ml por tubo. Del mismo modo derretir 2-3% (w / v) de agarosa en buffer (buffer M9 o huevo) y alícuota de 4-5 ml en tubos Falcon. Tenga cuidado de no hervir en exceso con el fin de minimizar la evaporación. En el día de la imagen, derretir un tubo de vaselina en un 65-70 º C del bloque de calor y fundir un tubo de agarosa en el horno de microondas, una vez más tener cuidado para minimizar hirviendo. Guarde los tubos en el bloque de calor para mantener la vaselina y la agarosa en estado fundido.
- Hacer agarosa almohadilla. Posición de una diapositiva nueva entre dos microscopía diapositivas guía, que se desliza cubiertos por una capa de cinta común de laboratorio adherido a la parte superior e inferior de cada diapositiva de guía. Utilice una pipeta Pasteur con el extremo roto de poner 2-3 gotas de agarosa derretida en la nueva diapositiva. Cubrir con una perpendicular 2 ª diapositiva a la diapositiva original, por lo que lo cubre y ayuda a difundir la agarosa para crear una plataforma cuadrada delgada. La diapositiva 2 º debe descansar sobre la cinta en las diapositivas guía. La concentración de agarosa puede ser mayor a un 5% más gruesas almohadillas.
- El uso de un microscopio de disección y un alambre de platino "pick", la transferencia de dos gusanos adultos a una caída del 9-12μL de tampón M9 o el huevo en un 18 mm x 18 mm cubreobjetos.
- Cortar los gusanos abrir con una aguja (que utilizamos 27G1 / 2 agujas) o un bisturí para liberar los embriones. Tratar de cortar en el medio de la lombriz.
- Menor de agarosa almohadilla (con el lado de agar hacia abajo) en el portaobjetos 18x18 mm que contiene los embriones. Agar corte se extiende desde el borde de la hoja de la cubierta con una hoja de afeitar.
- Sello cubreobjetos usando una brocha o un palo de madera delgado para aplicar la vaselina fundida para los cuatro bordes del cubreobjetos.
Alternativa a la monta agar cuelgan gotas de 23 años si los embriones son sensibles a la presión (es decir, si la cáscara del huevo no se forma correctamente). Imagen también se puede realizar en el útero para seguir la fertilización o principios de los acontecimientos, tales como meiosis. Gusanos debe ser anestesiados con levamisol 24. Con el fin de aumentar el número de embriones a partir de una determinada fase de desarrollo, varios gusanos pueden ser diseccionados a la vez y los embriones colocados juntos suavemente con una punta fina pipeta o un cepillo de pestañas o pipetear con la boca.
4D Nomarski DIC (contraste diferencial de interferencia) Películas
- A su vez en el microscopio Olympus BX61. Debido a que la cámara es sensible a las ondas electromagnéticas emitidas por otros dispositivos que se convirtió en el último, el bulbo de mercurio (si es necesario para las buenas prácticas agrarias o de fluorescencia) en primer lugar. Inicio Micro-Manager, una vez que todo está en. Elija el fichero de configuración apropiado para imágenes DIC o fluorescentes. La principal diferencia es que el archivo DIC no incluye el control de disparo fluorescentes. Cada archivo también selecciona el cubo correspondiente filtro y ajuste de la ganancia de la cámara.
- Encontrar embriones en el microscopio con objetivo de 10x. Mira cerca de los cuerpos de gusanos para grupos de embriones jóvenes con el fin de obtener varios embriones en el campo de la imagen. Evite los embriones en el interior del gusano de las mejores imágenes.
- Con el interruptor de software a un mayor aumento (40x a 100x) y la resolución (NA 0,9 a 1,4) para obtener imágenes de objetivo.
- Ajuste Nomarski óptica DIC (Los siguientes sitios web contienen una explicación útil de la óptica DIC y la terminología; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)- En nuestro Olympus BX61 los componentes importantes son los siguientes:
- Polarizador - deslizante debajo del condensador
- Condensador Wollaston Prisma - torreta en el condensador, justo debajo del escenario.
- Objetivo del prisma de Wollaston - barra deslizante debajo de los cubos de filtro
- 2 º polarizador (analizador) - cubo de filtro en la posición de DIC
- Interruptor de filtro Cubo de DIC a la posición del analizador (2 polarizador º) en la trayectoria de la luz (software debe hacer esto en el arranque).
- Asegúrese de que los dos polarizadores están correctamente alineados (cruzado). Cuando los dos prismas de Wollaston están fuera de la trayectoria de la luz del campo de visión debe ser oscuro. Si es necesario, girar el polarizador por debajo del condensador hasta que esto es correcto.
- Inserte el objetivo (superior) del prisma de Wollaston en la trayectoria de la luz.
- Girar la torreta en el condensador para seleccionar el prisma de Wollaston que coincide con el objetivo de que esté utilizando.
- Ajuste deslizante debajo de esta torreta para que coincida con AN de la lente.
- Enfoque del condensador para una óptima iluminación Koehler.
- Ajuste la parte superior del Pri Wollastonsm para conseguir un contraste óptimo girando el mando en el control deslizante.
- Otros ajustes controlados por el inicio de software incluyen el aumento de la cámara (a 0) y cambiar al guardar archivos como no de 8-bit 16-bit TIFF.
- En nuestro Olympus BX61 los componentes importantes son los siguientes:
- Ajuste el nivel de luz para dar buena imagen. (Por lo general utilizan 4.7 voltios) (controlado por software). Nosotros preferimos para iluminar la muestra para que los más brillantes píxeles están justo debajo de los niveles de saturación.
Un buen resultado de la óptica DIC en una imagen con un aspecto de 3 dimensiones, donde los gránulos de yema en el embrión se destacan claramente. Por otra parte esto puede ser descrito como si la luz que ilumina la muestra parece brillar desde un ángulo tal que una parte de la muestra (o las características de la muestra) es muy iluminado y el lado opuesto se encuentra en las sombras y aparece más oscura. - Seleccione Región de interés (ROI) para incluir a los embriones que desee a la imagen, haga clic en el botón Set retorno de la inversión para reducir la ventana.
- Abra la ventana de adquisición multi-dimensional. Seleccione Z-pilas (rodajas) y puntos de tiempo.
- Utilice el mando microscopio enfoque para encontrar la parte inferior del embrión (último plano focal con algunos gránulos de yema de enfoque). Haga clic en Seleccionar en la parte inferior. Repita el proceso para identificar y establecer la parte superior del embrión. Por lo general, utilizan un tamaño de micrones paso y terminar con ~ 20 planos focales. Por lo general, recogen múltiples planos focales en cada momento, porque los embriones y las células son relativamente gruesos. Además, especialmente cuando las células comienzan a dividirse en diferentes orientaciones que pueden desplazar a otras células en el embrión alrededor de moverlos dentro o fuera del plano focal original. Si el microscopio no tiene un motor de enfoque se puede ajustar manualmente el enfoque a seguir en la celda o el proceso que está interesado.
- Número de entrada de puntos de tiempo e intervalo de tiempo necesario. Por lo general, utilizan el intervalo de 15 segundos y un máximo de 500 puntos de tiempo. Empezamos con los puntos de tiempo más de lo que va a necesitar y detener la adquisición cuando se desee. Si usted es de imágenes múltiples planos focales, asegúrese de que haya tiempo suficiente para adquirir la totalidad de los planos focales en el intervalo entre los puntos de tiempo.
- Seleccionar o crear una ubicación para guardar los datos. Asegúrese que el software está configurado para mostrar la última imagen solamente. Dar un nombre al archivo y haga clic en Adquirir. Controlar la adquisición automática de imágenes de los puntos de tiempo de los primeros para asegurar su correcto funcionamiento.
- Haga clic en Detener cuando desee detener la adquisición, el interruptor con el objetivo de 10x y preparar la siguiente diapositiva.
- Cuando se hace de imágenes DIC eliminar los componentes de la trayectoria de la luz. Aceite de limpiar el objetivo, si es necesario. Apagar todo el equipo a partir de la cámara.
GFP Películas
- Inicio microscopio y buscar embriones que el anterior. Utilice el archivo de configuración que incluye software de control de disparo fluorescentes.
- Asegúrese de que el prisma superior DIC (slider) no está en la trayectoria de la luz.
- Interruptor de Cubo de filtro para FITC / GFP (ajusta automáticamente en el arranque)
- Cambio de ganancia cámara a 255 y el archivo de imagen a 16-bit TIFF (ajusta automáticamente en el arranque con el archivo de configuración).
- Apague la luz blanca.
- Haga clic en vivo de imágenes de vista preliminar. Trabaje con rapidez para reducir al mínimo la exposición de luz. Alternativamente, puede utilizar la imagen Ajustar a cobrar una sola imagen.
- Ajustar la potencia de lámpara de mercurio / filtros de densidad neutra, la longitud de la exposición para obtener una buena imagen. En general, se debe utilizar la luz mínima llegar a la muestra para obtener los datos que desee reducir el daño solar a la celda y photobleaching de las señales de fluorescencia.
- Establecer el intervalo de tiempo, el número de puntos de tiempo y el número de planos focales. A menudo usamos 5.10 segundos de intervalo y el plano focal 3.1.
- Seleccione retorno de la inversión y establecer los parámetros para la adquisición de la imagen como se describió anteriormente en los pasos 13-19.
Películas analizar
- Los datos se guardan en la carpeta con el nombre introducido y contienen una serie de archivos TIFF para cada imagen de la pila de 4D, un archivo de texto y un archivo de metadatos XML que contiene, tales como los niveles de exposición e intervalos de tiempo.
- Las imágenes TIFF puede ser abierto por ImageJ a través de dos métodos. El primero (método a) es el más simple y también leer los metadatos de cada archivo. El segundo (método b) es capaz de usar la memoria virtual para abrir los archivos que son más grandes que la cantidad de memoria asignada a ImageJ, pero no incluye los metadatos.
- Utilizando Micro-Manager Plugin
- Micro-Manager se basa en y utiliza ImageJ (que se instala una nueva versión de ImageJ que será diferente de cualquier otra versión que pueda tener previamente instalado) e incluye un plugin para abrir los datos. Alternativamente, usted puede copiar el contenido de la carpeta Micro-Manager-1.3/plugins a la carpeta de plugins para otra versión de ImageJ.
- Ir al menú Plugins, seleccione Micro-Manager y luego en Abrir Micro-gestor de archivos.
- Seleccione la carpeta que contiene los datos que desea ver y haga clic en Aceptar.
- Juega a través de las dimensiones de Z y T.
- Utilizando LOCI plugin para abrir películas con BioFormats importador.
- La transferencia de los archivos XML y TXT en la carpeta que contiene los archivos TIFF y cambiar el nombre de los dos archivos para que coincida con el nombre del conjunto de datos.
- Dentro de ImageJ, ir a los plug-ins del menú desplegable, seleccione LOCI y luego cualquiera de los navegadores de datos o formatos de Bio-importador.
- Encuentre la carpeta con tus pilas tiff. Haga clic en el primer archivo tiff, a continuación, abra.
- Ver pila con HyperStack. Bajo la organización del conjunto de datos: Seleccione los archivos del grupo con unas dimensiones de intercambio nombres similares, y abrir todas las series. Bajo la dirección de memoria: Seleccione: uso de la pila virtual (especialmente para grandes conjuntos de datos). Haga clic en Aceptar
- El plugin determinar las dimensiones del conjunto de datos (número de puntos de tiempo y de planos focales) y mostrar el rango de entre un conjunto de <> entre paréntesis. Haga clic en Aceptar o alterar el número de puntos de tiempo y / o planos focales para abrir.
- Confirme que la dimensión corresponde a cada serie.
- Juega a través de las dimensiones de Z y T.
- Utilizando Micro-Manager Plugin
Resultados representante
Alambiques Figura 1. De una película de Nomarski DIC ilustrar normal de los eventos celulares durante la primera C. elegans desarrollo del embrión: la migración pronuclear (0-5:45), primera división asimétrica (06:45-14:45) y la división asíncrona segundo (14:45-27:00). Los datos fueron recogidos con un lente de 60x 1,35 NA. 20 planos focales en intervalos de 1 micra se recogieron cada 15 segundos de exposición con 40 ms. Las imágenes fueron girados de forma que es posterior a la que está bien y ventral hacia abajo. Bar escala representan 10 micras.
Figura 2. Fotogramas de una película fluorescentes que ilustran el dinamismo de una subunidad de GFP-etiquetado de los complejos de pasajeros cromosoma (AIR-2) presente en los cromosomas de la metafase a la anafase temprana (de A a C) antes de aparecer en la zona media del huso en la anafase hasta citocinesis completa (C a F). Los datos fueron recogidos con un lente de 60x 1,35 NA. Un solo plano focal fue recogida cada 10 segundos de exposición con 50 microsegundos. Las imágenes fueron girados de forma que es posterior a la derecha. Bar escala representan 10 micras.
Movie 1 Nomarski película de tipo salvaje embriones.
Película correspondiente a la Figura 1. Posterior es a la parte inferior derecha y ventral es la parte inferior izquierda. Muestra un solo plano focal del conjunto de datos original. La imagen fue recogida cada 15 segundos y la reproducción es de 14 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el video
Movie 2 Movie fluorescente de tipo salvaje embriones que expresan GFP:: AIR-2.
Película correspondiente a la Figura 2. Posterior es a la parte superior derecha. Película se recogió como un plano focal simple. La imagen fue recogida cada 10 segundos y la reproducción es de 14 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para ver el video
Discussion
Una consideración importante para vivir el tiempo-lapse de imágenes es la de preservar la integridad y la viabilidad de la célula y el organismo. Microscopía DIC ofrece la ventaja de que la muestra no está expuesto a la luz ultravioleta y un calentamiento excesivo de la fuente de iluminación. Microscopía DIC es muy adecuado para detectar la migración de las células y cambios en las células la forma como la citocinesis y de identificar algunas estructuras subcelulares, como el huso mitótico y la membrana nuclear. Imágenes de fluorescencia de las proteínas reportero complementa microscopía DIC por identificar otros compartimentos subcelulares y que permite la visualización de proteínas específicas. Para mitigar los riesgos de fototoxicidad y daños en el embrión durante imágenes de fluorescencia, por lo general aumenta la ganancia digital de la cámara para compensar la intensidad de la luz ultravioleta y reduce la duración de la iluminación. Para los periodistas débil transgénicos fluorescentes, los algoritmos de deconvolución para reasignar fuera de foco de luz o algoritmos deblurring para reducir el fondo puede mejorar la calidad de las imágenes capturadas. Mientras que los microscopios avanzados tales como los sistemas confocal o multifotónica a veces son necesarias, hemos encontrado que muchos reporteros fluorescentes se pueden crear imágenes con esta configuración microscopio de epifluorescencia, produciendo imágenes de alta calidad.
Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), además de ser gratuito, guarda los archivos directamente en formato tiff en lugar de formatos de archivos propietarios de muchos paquetes de software comercial. Esto simplifica considerablemente el análisis de nuestros datos al eliminar el paso de conversión de archivos necesario para leer los archivos de imagen ImageJ, Photoshop y otros programas de edición de imágenes.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Fondos internos institucionales y las Ciencias Biológicas Programa de Becas de la Universidad de Michigan apoya este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
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