הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Summary

Abstract

תהליכים תאיים, כגון הפרדה הרכבה, כרומוזום ו cytokinesis, הם דינמיים מטבעם. זמן לשגות הדמיה של תאים חיים, באמצעות ניאון שכותרתו חלבונים הכתב או הפרעה ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה, מאפשר בחינה של התקדמות הזמני של האירועים הללו דינמי אשר להסיק אחרת מניתוח של ^1,2 דגימות קבוע. יתרה מכך, המחקר של תקנות התפתחותיים של תהליכים תאיים מחייבת ניהול זמן לשגות ניסויים על אורגניזם שלם במהלך הפיתוח. העובר elegans Caenorhabiditis אור שקוף יש תוכנית מהירה, התפתחותי משתנה עם תא ידוע שושלת ^3, ובכך לספק מודל ניסוי אידיאלי לבחינת שאלות בביולוגיה של התא ^4,5 ופיתוח ^6-9. ג elegans היא amendable כדי מניפולציה גנטית על ידי קדימה גנטיקה (מבוסס על mutagenesis אקראי ^10,11) גנטיקה הפוכה למקד גנים ספציפיים (מבוסס על הפרעה RNAi בתיווך ממוקד mutagenesis ^12-15). בנוסף, חיות טרנסגניות ניתן ליצור בקלות להביע את החלבונים המתויגים fluorescently או כתבים ^16,17. תכונות אלה משלבים כדי שיהיה קל לזהות את המסלולים הגנטיים בוויסות תהליכים תאיים והתפתחותית היסוד in vivo ^18-21. בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטות הדמיה חיה של C. עוברים elegans באמצעות אופטיקה DIC או פלואורסצנטי GFP על מיקרוסקופ epifluorescent המתחם. אנו מדגימים את הקלות שבה מיקרוסקופים זמינים, משמש בדרך כלל הדמיה מדגם קבוע, יכול להיות מיושם גם לניתוח זמן לשגות באמצעות תוכנות קוד פתוח כדי למכן את תהליך ההדמיה.

Protocol

תולעת הכנה

1. העברת L4 תולעים הזחל אל צלחות המתאים 18-24hrs לפני הדמיה ^22. זה יבטיח לך ביצה נושאות מבוגרים לאספקת שפע של עוברי מוקדם.
2. הכן צינורות וזלין, agarose. אנחנו מכינים כמה צינורות 15ml בז ידי התכה וזלין בכוס במיקרוגל מחלק לתוך aliquot 4-5 מ"ל לכל צינור. בדומה להמיס 2-3% (w / v) agarose ב הצפת (M9 או ביצה הצפת) ו aliquot 4-5 מ"ל לתוך צינורות בז. להיזהר לא להרתיח את עודף על מנת לצמצם התאדות. ביום של הדמיה, להמיס 1 שפופרת של וזלין בתוך בלוק 65-70 מעלות צלזיוס חום להמיס 1 שפופרת של agarose במיקרוגל, שוב להיזהר כדי למזער רותחים. חנות צינורות לחסום את חום כדי לשמור על וזלין ואת agarose במצב מותך.
3. הפוך את agarose כרית. מיקום שקופיות מיקרוסקופ חדש בין 2 שקופיות מדריך, אשר שקופיות מכוסה בשכבה אחת של סרט מעבדה משותפת דבק העליון והתחתון של כל שקופית מדריך. השתמש פיפטה פסטר עם סוף נשבר למקום 2-3 טיפות agarose נמס בשקופית חדשה. מכסים הניצב 2 ^nd שקופית לשקופית המקורית, כך שהוא מכסה ועוזר להפיץ את agarose כדי ליצור משטח מרובע דק. השקופית 2 ^nd צריך לנוח מעל הקלטת בשקופיות מדריך. ריכוז agarose ניתן להעלות ל -5% עבור פדים עבים.
4. שימוש היקף הניתוח, חוט פלטינה "להרים", להעביר 2 תולעים בוגרות לירידה 9-12μL של הצפת M9 או ביצה על 18 x 18 מ"מ coverslip.
5. גזור תולעים לפתוח עם מחט (נשתמש 27G1 / 2 מחטים) או אזמל לשחרר עוברים. נסו לחתוך באמצע של התולעת.
6. תחתון agarose כרית (עם הצד אגר למטה) על coverslip 18x18 מ"מ המכילים את העוברים. אגר חתוך הארכת מקצה להחליק את המכסה עם סכין גילוח.
7. חותם coverslip באמצעות מכחול או מקל עץ דק ליישם את וזלין נמס אל כל ארבעת הקצוות של coverslip.

חלופיות mounts אגר תלויות טיפות ²³ אם עוברים רגישים ללחץ (כלומר, אם פגז ביצה לא טופס כמו שצריך). הדמיה יכולה גם להתבצע ברחם לעקוב אחרי הפריה או אירועים מוקדם כגון המיוזה. תולעים צריך להיות מורדם עם Levamisole ^24. על מנת להגדיל את מספר העוברים משלב מסוים של התפתחות, תולעים כמה יכול להיות גזור בבת אחת ואת מיקומו עוברים יחד בעדינות בעזרת קצה עדין פיפטה או מברשת ריסים או pipetting הפה.

4D Nomarski DIC (הפרעה דיפרנציאלי ניגודיות) סרטים

8. הפעל מיקרוסקופ אולימפוס BX61. כי המצלמה היא רגישה EM גלים הנפלטים על ידי מכשירים אחרים הוא דולק האחרון, נורת כספית (במידת הצורך עבור GFP או פלואורסצנטי) הראשון. התחל Micro-מנהל פעם הכל על. בחר את קובץ ההגדרות המתאים הדמיה DIC או פלורסנט. ההבדל העיקרי הוא כי תיק DIC אינו כולל שליטה על הצמצם ניאון. כל קובץ גם בוחר את הקוביה הסינון המתאים ולהשיג הגדרת מצלמה.
9. מצא את העוברים על מיקרוסקופ באמצעות המטרה 10x. תראו ליד גופות תולעת לקבוצות של צעירים עוברים על מנת לקבל עוברים מרובים בתחום ההדמיה. הימנע עוברים בתוך התולעת הטובה ביותר עבור תמונות.
10. באמצעות מתג התוכנה הגדלה גבוהה (40X כדי 100x) ורזולוציה (NA 0.9-1.4) המטרה הדמיה.
11. התאם Nomarski DIC אופטיקה (באתרי האינטרנט הבאים מכילים הסבר מועיל האופטיקה DIC ואת המינוח; http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
    http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)
    1. ביום BX61 אולימפוס שלנו המרכיבים החשובים הם:
       1. מקטב - המחוון למטה הקבל
       2. Condenser פריזמה וולאסטון - הצריח על הקבל, ממש מתחת לבמה.
       3. פריזמה המטרה וולאסטון - המחוון מתחת קוביות מסנן
       4. 2 ^nd מקטב (Analyzer) - קוביה המסנן במצב DIC
    2. החלף Cube מסנן DIC לתפקיד Analyzer (2 ^nd מקטב) בנתיב האור (תוכנה צריכים לעשות את זה על סטארט אפ).
    3. ודא כי שני מקטבים מיושרים כראוי (חצה). כאשר הן מנסרות וולאסטון מחוץ נתיב האור את שדה הראיה צריך להיות כהה. אם יש צורך, לסובב את מקטב להלן הקבל עד זה נכון.
    4. הכנס את (העליון) המטרה וולאסטון פריזמה לתוך נתיב האור.
    5. סובב את הצריח על הקבל כדי לבחור את פריזמה וולאסטון התואמת את המטרה אתה משתמש.
    6. התאם את המחוון מתחת לצריח זה כדי להתאים NA של העדשה.
    7. פוקוס הקבל לתאורה קוהלר אופטימלית.
    8. התאם העליון וולאסטון פריsm לקבל בניגוד אופטימלית על ידי סיבוב הידית על המחוון.
    9. הגדרות אחרות שבשליטת ההפעלה תוכנה כוללים רווח המצלמה (מוגדר 0) ולעבור שמירת קבצים כמו 8-bit 16-bit לא קבצי TIFF.
12. התאם את רמת האור לתת תמונה יפה. (בדרך כלל להשתמש 4.7 וולט) (נשלט באמצעות תוכנה). אנחנו מעדיפים כדי להאיר את המדגם כך הפיקסלים הבהירים הם רק מתחת לרמות הרוויה.
    טוב אופטיקה תוצאות DIC בתמונה עם מבט 3 מימדי שבו גרגרי חלמון בעובר להתבלט בבירור. לחילופין זה יכול להיות מתואר כאילו האור המאיר את המדגם נראה להאיר מזווית כך צד אחד של המדגם (או תכונות במדגם) הוא המואר והצד השני הוא הצללים מופיע כהה.
13. בחר אזור עניין (ROI) כדי לכלול את העוברים אתה רוצה תמונה, לחץ על כפתור לקבוע את ההחזר על ההשקעה להפחית החלון.
14. פתח את חלון רב מימדי הרכישה. בחר Z-ערימות (פרוסות) ונקודות זמן.
15. השתמש להתמקד ידית מיקרוסקופ כדי למצוא את החלק התחתון של העובר (מישור המוקד האחרון עם כמה גרגרי חלמון בפוקוס). לחץ בתחתית בחר. חזור לזהות ולהגדיר את החלק העליון של העובר. בדרך כלל אנו משתמשים 1 צעד בגודל מיקרון בסופו של דבר עם ~ 20 מטוסים מוקד. בדרך כלל אנחנו אוספים מטוסים מוקד מרובים בכל נקודת זמן כי עוברים ותאי עבים יחסית. בנוסף במיוחד כאשר התאים מתחילים להתחלק ב נטיות שונות הם יכולים לעקור תאים אחרים סביב העובר להעביר אותם או הקטנה של המטוס המוקד המקורי. אם מיקרוסקופ שלך אין מנוע פוקוס ידני אתה יכול להתאים את המוקד פעל התא או תהליך אתם מעוניינים.
16. מספר קלט של נקודות זמן במרווח הזמן הדרוש. אנחנו בדרך כלל להשתמש במרווח 15 שניות וקבע מקסימום של 500 נקודות הזמן. אנחנו מתחילים עם נקודות יותר זמן נצטרך לעצור את הרכישה בעת הצורך. אם אתה מרובים הדמיה מטוסים מוקד, יש לוודא שיש מספיק זמן כדי לרכוש את כל המטוסים מוקד מרווח בין נקודות הזמן.
17. בחר או ליצור מיקום לשמירת נתונים. ודא כי התוכנה מוגדרת להצגת התמונה האחרונה בלבד. תן לקובץ שם ולחץ רוכשת. צג רכישת תמונה אוטומטית את הנקודות לראשונה כמה כדי להבטיח שהוא פועל כהלכה.
18. לחץ להפסיק מתי שאתה רוצה להפסיק את הרכישה, עבור מטרה 10x ולהכין את השקופית הבאה.
19. בסיום הדמיה להסיר רכיבים DIC מנתיב האור. שמן נקי את המטרה במידת הצורך. הפעל את הכל החל עם המצלמה.

GFP סרטים

20. התחל מיקרוסקופ ולמצוא עוברים לעיל. השתמש קובץ התצורה הכוללת תוכנת שליטה של ​​תריס ניאון.
21. ודא כי פריזמה DIC העליון (המחוון) אינו בנתיב האור.
22. החלף Cube מסנן FITC / GFP (מוגדר באופן אוטומטי באתחול)
23. שנה להשיג מצלמה עד 255 ו קובץ תמונה 16-bit Tiff (מוגדר באופן אוטומטי באתחול עם קובץ התצורה הזו).
24. כבה את האור הלבן.
25. לחץ חי הדמיה תמונת התצוגה המקדימה. עבודה במהירות כדי לצמצם את החשיפה לאור. לחילופין להשתמש תמונה הצמד לאסוף תמונה בודדת.
26. התאמת כוח מרקורי הנורה / מסננים צפיפות ניטרלי, אורך חשיפה כדי לקבל תמונה טובה. באופן כללי, כדאי להשתמש באור מינימום להגיע מדגם לרכוש את הנתונים שברצונך לצמצם נזקי לצינוק photobleaching של אותות הקרינה.
27. הגדרת מרווח זמן, מספר נקודות זמן של מספר מטוסים מוקד. אנו מרבים להשתמש במרווחים second 5-10 והמטוס מוקד 1-3.
28. בחר ROI ולהגדיר פרמטרים לרכישת התמונה כמתואר לעיל שלבים 13-19.

ניתוח סרטים

29. הנתונים יישמרו בתיקיה עם השם שהזנת מכילים סדרה של קבצי tiff עבור כל תמונה של מחסנית 4D, קובץ טקסט ו metadata קובץ XML המכיל כגון רמות החשיפה במרווחי זמן.
30. תמונות TIFF ניתן לפתוח על ידי ImageJ באמצעות שתי שיטות. הראשון (שיטה) היא הפשוטה גם לקרוא את metadata של כל קובץ. השני (שיטה ב) הוא מסוגל להשתמש בזיכרון וירטואלי כדי לפתוח קבצים שגודלם עולה על כמות הזיכרון המוקצה ImageJ, אבל זה אינו כולל את metadata.
    1. באמצעות מיקרו-מנהל Plugin
       1. Micro-מנהל בנויה על ומשתמש ImageJ (היא מתקינה גירסה חדשה של ImageJ אשר יהיה שונה מכל גירסה אחרת ייתכן שהתקנת בעבר) והוא כולל תוסף כדי לפתוח נתונים. לחילופין אתה יכול להעתיק את תוכן התיקייה Micro-Manager-1.3/plugins לתיקיית plugins עבור גרסה אחרת של ImageJ.
       2. לכו לתפריט תוספים, בחר Micro-מנהל ואז מנהל קבצים Micro-Open.
       3. בחר את התיקייה המכילה את הנתונים שברצונך להציג ולחץ על אישור.
       4. שחק דרך הממדים Z ו-T.
    2. שימוש לוקוסים plugin כדי לפתוח סרטים עם יבואן BioFormats.
       1. העברת קבצי XML ו-txt מתוך התיקיה המכילה את קבצי TIFF, ושנה את שני הקבצים כדי להתאים את השם של ערכת הנתונים.
       2. בתוך ImageJ, עבור תוספים לנתץ התפריט, בחר לוקוסים ולאחר מכן דפדפן נתונים או ביו פורמטים יבואן.
       3. מצא את התיקייה עם ערימות tiff שלך. לחץ על קובץ TIFF הראשון, ולאחר מכן לפתוח.
       4. צפה מחסנית עם Hyperstack. תחת ארגון במערך: בחר קבצים קבוצה עם ממדים שמות דומים, Swap ולפתוח את כל הסדרה. תחת ניהולו זיכרון: בחר: השתמש מחסנית וירטואלית (במיוחד עבור ערכות נתונים גדולות). לחץ על אישור
       5. תוסף תקבע את הממדים של הנתונים להגדיר (# של נקודות זמן ומטוסים מוקד) ולהציג את הטווח בין קבוצה של <> בסוגריים. לחץ על אישור או לשנות את מספר נקודות זמן ו / או מטוסים מוקד לפתוח.
       6. אשר בה מימד מקביל כל סדרה.
       7. שחק דרך הממדים Z ו-T.

נציג תוצאות

באיור 1. סטילס מסרט Nomarski DIC הממחישות אירועים הסלולר נורמלי במהלך C. מוקדם elegans התפתחות העובר: הגירה pronuclear (0-5:45), הדיוויזיה הראשונה אסימטרי (6:45-14:45) ואת הליגה השניה אסינכרוני (14:45-27:00). הנתונים נאספו עם עדשה 60x NA 1.35. 20 מטוסים מוקד ב 1 במרווחים מיקרון נאספו כל 15 שניות עם חשיפה μs 40. תמונות היו מסובבים כך האחורי כלומר הזכות הגחון הוא למטה. בר קנה מידה מייצגים 10 מיקרון.

איור 2. סטילס מסרט פלורסנט הממחישות את תנועות דינמיות של למקטע GFP שכותרתו של מורכבות הנוסע כרומוזום (AIR-2) ההווה על הכרומוזומים מפני metaphase כדי anaphase מוקדם (A ל-C) לפני המופיעים midzone ציר ב anaphase עד cytokinesis משלים (C ל-F). הנתונים נאספו עם עדשה 60x NA 1.35. מטוס מוקד יחיד נאסף כל 10 שניות עם חשיפה μsec 50. תמונות היו מסובבים כך האחורי כלומר ימינה. בר קנה מידה מייצגים 10 מיקרון.

סרט 1 סרט Nomarski של העובר wild-type.
סרט המתאים באיור 1. Posterior הוא לתחתית ימין הגחון היא השמאלית התחתונה. הופעות מטוס מוקד יחיד של הנתונים המקוריים שנקבעו. תמונה נאסף כל 15 שניות ולהשמיע מוגדר 14 מסגרות לשנייה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

2 סרט סרט פלורסנט של העובר wild-type GFP לבטא: AIR-2.
המתאים איור 2 סרט. Posterior היא הימנית העליונה. סרט נאסף כמו מטוס מוקד יחיד. תמונה נאסף כל 10 שניות ולהשמיע מוגדר 14 מסגרות לשנייה. לחץ כאן כדי לצפות וידאו

Discussion

שיקול מרכזי עבור דימות זמן לשגות לחיות היא לשמר את היושרה ואת הכדאיות של התא ושל האורגניזם. מיקרוסקופיה DIC מספק את היתרון כי המדגם אינו נחשף לאור אולטרה סגול וחימום יתר ממקור תאורה. מיקרוסקופיה DIC הוא גם מתאים כדי לזהות נדידת תאים וצורתם תא שינויים כגון cytokinesis כדי לזהות כמה מבנים subcellular, כגון ציר mitotic ואת קרום הגרעין. דימות פלואורסצנטי של חלבונים כתב משלים מיקרוסקופיה DIC ידי זיהוי תאים subcellular נוסף המאפשר הדמיה של חלבונים מסוימים. כדי להקטין את הסכנות של phototoxicity ופגיעה בעובר במהלך דימות פלואורסצנטי, אנחנו בדרך כלל להגדיל את הרווח דיגיטלי של המצלמה כדי לקזז את UV מופחת אור בעוצמה ומשך התאורה. עבור קלוש כתבים מהונדס פלורסנט, אלגוריתמים deconvolution כדי להקצות מחדש מחוץ להתמקד אלגוריתמים אור או deblurring להפחית רקע יכול לשפר את האיכות של התמונות שנתפסו. בעוד מיקרוסקופים מתקדמים, כגון מערכות confocal או multiphoton הם לפעמים יש צורך, מצאנו כי הכתבים ניאון רבים ניתן הדמיה באמצעות התקנה זו מיקרוסקופ epifluorescent, מניב תמונות באיכות גבוהה.

Micro-Manager (http://www.micro-manager.org), בנוסף להיותו חינם, שומר קבצים ישירות בפורמט TIFF במקום פורמטים של קבצים קניינית של הרבה חבילות תוכנה מסחריות. זו משמעותית מפשט את ניתוח הנתונים שלנו על ידי ביטול המרת קובץ הצעד הדרוש כדי לקרוא את קבצי התמונה ImageJ, Photoshop ו תוכנה אחרת לעריכת תמונות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses	Olympus Corporation
Micro-Manager 1.3.46	Micro-Manager		http://www.micro-manager.org
Image J 1.43			http://rsbweb.nih.gov/ij
loci_tools.jar			http://www.loci.wisc.edu
Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Laboratory tape	Fisher Scientific	15-901
18 mm x 18 mm #1.5 coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade	BD Biosciences