Summary
Abstract
Kromozom montaj, ayrımcılık ve sitokinez gibi hücresel süreçleri, doğal olarak dinamik. Floresan etiketli muhabiri proteinler ya da diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi kullanılarak canlı hücreler Time-lapse görüntüleme, inceleme için, aksi takdirde, sabit örnekleri 1,2 analiz anlaşılmaktadır bu dinamik olayların zamansal ilerleme sağlar. Ayrıca, hücresel süreçlerin gelişim düzenlemelere çalışma gelişimi sırasında sağlam bir organizma üzerinde zaman atlamalı deneylerini gerektirmektedir. Caenorhabiditis elegans embriyo, böylece 4,5 ve gelişimi 6-9 hücre biyolojisi sorular çalışmak için ideal bir deney modeli, ışık-şeffaf ve hızlı bir şekilde bilinen bir hücre ile 3 soyundan, değişmez bir gelişim programı C. elegans ileri genetik (rastgele mutagenez 10,11) ve belirli genlerin hedef ters genetik (RNAi-aracılı girişim dayalı ve hedeflenen mutagenez 12-15) genetik manipülasyon iyileştirilebilir. Buna ek olarak, transgenik hayvanlar kolayca, floresan tagged proteinleri veya gazetecilere 16,17 ifade etmek için oluşturulmuş olabilir . Bu özellikler, in vivo 18-21 temel hücresel ve gelişimsel süreçleri düzenleyen genetik yollar kolay tanıyabilmek için birleştirir . Bu protokolde C. canlı görüntüleme yöntemleri mevcut DIC optik veya GFP floresans bir bileşik epifluorescent mikroskop kullanarak elegans embriyolar. Biz genellikle sabit örnek görüntüleme için kullanılan hazır mikroskoplar, görüntüleme işlemi otomatikleştirmek için açık kaynak kodlu yazılım kullanarak zaman atlamalı analizi için de uygulanabilir olan kolaylığı göstermektedir.
Protocol
Solucan Hazırlık
- 22 görüntüleme önce uygun plakaları 18-24 saat L4 larva solucanlar aktarın. Bu size bol kaynağı için erken embriyo yumurta taşıyan yetişkinler var sağlayacaktır.
- Vazelin ve Agaroz tüpleri hazırlayın. Biz mikrodalga beher vazelin erime ve tüp başına 4-5 ml kısım içine dağıtım birkaç 15 mL şahin tüpler hazırlar. Benzer şekilde% 2-3 oranında (w / v) Agaroz (M9 veya Yumurta Buffer) Tampon ve şahin tüpler içine kısım 4-5 ml eritebilir. Buharlaşmasını en aza indirmek için aşırı kaynatmak için dikkatli olun. Görüntüleme gününde, 65-70 ° C ısıya blokta 1 tüp vazelin eritebilir ve mikrodalga 1 tüp agaroz eritebilir, yine Üzerine kaynar en aza indirmek için dikkatli olun. Tüpler, erimiş durumda vazelin ve Agaroz tutmak için ısı bloğu içinde saklayın.
- Agaroz pad olun. Her kılavuzu slayt üst ve alt yapıştırılır tek bir katmanı tarafından ortak laboratuvar bant kaplı slaytlar 2 kılavuz slaytlar arasındaki yeni bir mikroskobu slayt yerleştirin. Yeni bir slayt 2-3 damla erimiş Agaroz yere kopmuş sonunda Pasteur, pipet kullanın. Kapak, özgün slayt 2. slayt dik kapsar ve ince bir kare takımını oluşturmak için Agaroz yaymak için yardımcı olduğu. 2. slayt kılavuz kızaklar üzerinde bant üzerinde dinlendirilmeli. Agaroz konsantrasyonu kalın pedler için% 5 artış olabilir.
- 18 mm x 18 mm lamel M9 veya Yumurta Tampon 9-12μL damla, bir diseksiyon kapsamı ve bir platin tel kullanarak transferi 2 yetişkin solucanlar "almak".
- (27G1 / 2 iğne kullanımını) bir iğne veya embriyoları serbest neşter ile açık solucanlar kesin. Solucanın ortasında kesmek için deneyin.
- Embriyoların içeren 18x18 mm lamel üzerine Agaroz pad (agar yüzü aşağı) indirin. Trim agar bir jilet ile kapak kayma kenarına uzanan.
- Seal lamel dört kenarları eritilmiş vazelin uygulamak için bir fırça veya ince tahta sopa kullanarak lamel.
(Yani düzgün bir şekilde yumurta kabuğu biçiminde olmazsa) embriyolar basınca duyarlı olup olmadığını asılı olan agar bağlar Alternatif 23 düşer. Görüntüleme da gübreleme, mayoz bölünme gibi erken olayları takip etmek in utero yapılabilir. Worms Levamizol 24 ile anestezi olmalıdır. Gelişimin belirli bir aşamasında embriyo sayısını artırmak amacıyla, çeşitli solucanları bir zaman ve yavaşça pipet ucu ince veya bir kirpik fırçası ile birlikte yerleştirilmiş embriyolar ya da ağız pipetleme disseke olabilir.
4D Nomarski DIC (Diferansiyel Girişim Kontrast) Filmler
- Olympus BX61 mikroskop açın. Kamera, diğer cihazlar tarafından yayılan EM dalgalar hassas çünkü son cıva ampul (GFP veya floresan için gerekirse) ilk açıktır. Her şeyi bir kez Micro-Yöneticisi'ni başlatın. DIC veya floresan görüntüleme için uygun bir konfigürasyon dosyası seçin. En önemli fark, DIC dosya floresan deklanşör kontrolü içermez. Her dosya, aynı zamanda uygun filtre küp ve kamera kazanç ayarı seçer.
- 10x objektif ile mikroskop embriyolar bul. Görüntüleme alanı içinde birden fazla embriyolar elde etmek için genç embriyoların gruplar için solucan organları yakın bakın. En iyi görüntü için solucan içinde embriyolar kaçının.
- Amacı görüntüleme (1.4 NA 0.9) daha yüksek bir büyütme (40x 100x için) ve çözünürlük yazılım anahtarını kullanma.
- Nomarski DIC Optik ayarlayın (aşağıdaki web sitelerini yararlı DIC optik açıklama ve terminoloji içeren http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html
http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html)- Olympus BX61 tarihinde önemli bileşenleri şunlardır:
- Polarize - kondenser altında kaydırıcıyı
- Kondenser Wollaston Prizma taret kondenser, sahne hemen altında.
- Amaç Wollaston Prizma - filtre küpler altında kaydırıcıyı
- 2. Polarize (Analyzer) - DIC pozisyonda filtre küp
- DIC Filtre Küp ışık yolu (yazılım başlangıç yapmalısınız) Analyzer (2. polarize) konumuna geçin.
- Iki polarize düzgün hizalanmış (çapraz) emin olun. Işık yolu her iki Wollaston prizmalar zaman görüş alanı koyu renkli olmalıdır. Gerekirse, bu doğru kadar kondenser altındaki polarize döndürün.
- Işık yolu ise objektif (üst) Wollaston Prizma yerleştirin.
- Kullandığınız amacı ile eşleşen Wollaston prizma seçmek için kondansatör taret döndürün.
- Bu taret altında objektif NA maç sürgüsünü ayarlayın.
- Köhler optimum aydınlatma için kondenser odaklanın.
- Üst Wollaston Pri ayarlayın.sm kaydırıcıyı düğmeyi döndürerek en iyi kontrast elde etmek için.
- Diğer ayarlar yazılım başlangıç tarafından kontrol kamera kazanç (0) ve 8-bit, 16-bit TIFF dosyaları olarak dosyaları kaydetmek geçmek içerir.
- Olympus BX61 tarihinde önemli bileşenleri şunlardır:
- Güzel bir imaj vermek için ışık seviyesini ayarlayın. (Genellikle 4.7 Volt) (yazılım üzerinden kontrol). Parlak piksel doygunluk seviyelerini aşağıda ki örnek aydınlatmak için tercih ediyor.
Embriyo sarısı granül açıkça göze çarpıyor 3-boyutlu bir görünüme sahip bir görüntü İyi DIC optik sonuçları. Örnek aydınlatan ışık, bir açıdan örnek bir tarafında (ya da örnek özellikleri) aydınlık ve karşı tarafında gölgeler ve koyu görünür böylece parlaklık görünüyor sanki Alternatif olarak tarif edilebilir. - Faiz (ROI) Bölge seçin resme istediğiniz embriyolar, pencere azaltmak için yatırım getirisi düğmesini tıklatın.
- Çok boyutlu bir satın alma penceresini açın. Z-yığınlarının (dilim) ve Zaman Puanlar seçin.
- Embriyonun alt (odak bazı sarısı granül ile son odak düzlemi) bulmak için mikroskop odak düğmesini kullanın. Seç alt tıklayın. Embriyonun üst belirlemek ve ayarlamak için tekrarlayın. Biz genellikle 1 mikron adım boyutu ~ 20 odak uçakları ile sonuna kadar. Embriyoların ve hücrelerin nispeten kalın, çünkü genelde her zaman bir noktada birden fazla odak düzlemleri toplamak. Buna ek olarak, hücrelerin farklı yönlerde bölünmeye başlar, özellikle orijinal odak düzlemi içinde veya dışında hareket embriyonun çevresindeki diğer hücreleri yerinden yapabilirsiniz. Mikroskop bir odak motor yoksa el ilgilendiğiniz hücre veya süreci takip odağı ayarlayabilirsiniz.
- Zaman noktaları ve zaman aralığı Giriş sayısı gerekiyordu. Biz genellikle 15 saniye arayla kullanmak ve maksimum 500 puan ayarlayabilirsiniz. Biz daha fazla zaman noktaları ile istenildiği zaman satın alma ihtiyaç ve duracağız daha başlar. Eğer birden fazla odak düzlemleri görüntüleme yapıyorsanız, tüm odak düzlemleri zaman noktaları arasındaki aralığı elde etmek için yeterince zaman olduğu emin olun.
- Verileri kaydetmek için bir konum seçin veya oluşturun. Yazılım, sadece son görüntüyü göstermek için ayarlanmış olduğundan emin olun. Dosyanın bir ad verin ve Acquire tıklatın. Düzgün çalıştığından emin olmak için ilk birkaç zaman noktaları için otomatik görüntü elde etme izleyin.
- Satın durdurmak için istediğiniz zaman durdurmak, 10x objektif geçmek ve bir sonraki slayt hazırlamak.
- Bittiğinde görüntüleme ışık yolu DIC bileşenleri kaldırmak. Amacı gerekli özelliğine temizleyin petrol. Kamera ile başlayarak kapalı her şeyi açın.
GFP Filmler
- Mikroskop başlatın ve yukarıdaki gibi embriyolar bulmak. Floresan deklanşöre yazılım kontrolü içerir yapılandırma dosyasını kullanın.
- Üst DIC prizma (kaydırıcı), ışık yolu olmadığından emin olun.
- Anahtar FITC / GFP Filtre Cube (başlangıçta otomatik olarak ayarlanır)
- 16-bit TIFF (Bu yapılandırma dosyası ile başlangıçta otomatik olarak ayarlanır) Kamera kazanç ve görüntü dosyası 255 olarak değiştirin.
- Beyaz ışık kapatın.
- Önizleme görüntüsü için tıklayın Canlı Görüntüleme. Işığa maruz kalma en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışın. Alternatif olarak, tek bir görüntü toplamak Snap to Resim kullanın.
- Merkür ampul gücü / nötral yoğunluk filtreleri, iyi bir görüntü elde etmek için poz süresini ayarlayın. Genel olarak, en az ışık floresan sinyalleri hücre ve photobleaching fotohasar azaltmak için istediğiniz verileri almak için örnek ulaşan kullanmanız gerekir.
- Zaman aralığı, zaman noktalarının sayısı ve odak düzlemleri sayısını ayarlayın. Biz genellikle 5-10 saniyelik aralıklarla ve 1-3 odak düzlemli kullanın.
- ROI seçin ve görüntü elde etmek için Adımlar 13-19 daha önce açıklandığı gibi parametrelerini ayarlamak.
Analiz Filmler
- Veri girdiğiniz ad ile klasör ve tiff dosyaları 4D yığını her görüntü için bir dizi, bir metin dosyası ve maruz kalma seviyeleri ve zaman aralıkları gibi bir xml dosyası içeren meta verilerini içeren kaydedilir.
- Tiff görüntüleri iki yöntem ile ImageJ açılabilir. (Yöntem) ilk olarak basit ve aynı zamanda her dosyanın meta verilerini okuyacaktır. (Yöntem b) ikinci ImageJ için ayrılan bellek miktarını daha büyük dosyaları açmak için sanal bellek kullanımı mümkün, ancak meta içermez.
- Micro-Manager Plugin kullanarak
- Micro-Manager üzerine inşa ve kullanımları ImageJ (önceden yüklenmiş olabilir başka bir sürümden farklı olacak, ImageJ yeni bir sürümünü yükler) ve veri açmak için bir eklenti içerir. Alternatif olarak, ImageJ başka bir versiyonu için plugins klasörüne Micro-Manager-1.3/plugins klasörün içeriğini kopyalayabilirsiniz.
- Plugins menüsüne git Mikro-Manager seçin ve ardından Açık Mikro-Yöneticisi Dosya.
- Ve ok tıklayın görmek istediğiniz verileri içeren klasörü seçin.
- Z ve T boyutları ile oynayın.
- Loci plugin ile film BioFormats İthalatçı açmak için.
- Tiff dosyalarını içeren klasörü Transferi, xml ve txt dosyaları ve veri kümesi adını maç için iki dosyayı yeniden adlandırmak.
- ImageJ içinde, Veri Browser ya da Bio-Formatları İthalatçı ya da daha sonra Eklentiler menü aşağı çekme, Loci seçin.
- Tiff yığınları ile klasörü bulun. Ilk tiff dosya üzerine tıklayın, sonra açın.
- Hyperstack ile yığını. Dataset organizasyon çerçevesinde: Benzer isimler, Takas boyutları ile Grup Dosyaları seçin ve tüm serileri açın. Bellek yönetimi altında:: sanal bir yığın (özellikle büyük veri setleri için) kullanın. Ok deyin
- Eklentisi veri seti boyutları (# zaman noktaları ve odak düzlemleri) belirlemek ve bir dizi <> parantez aralığında gösterecektir. Ok tıklayın veya zaman noktaları ve / veya açmak için odak düzlemleri sayısını değiştirebilirsiniz.
- Boyut, her seri karşılık geldiğini onaylayın.
- Z ve T boyutları ile oynayın.
- Micro-Manager Plugin kullanarak
Temsilcisi Sonuçlar
Nomarski DIC film Şekil 1 Stills erken C. sırasında normal hücresel olayları gösteren elegans embriyo gelişimi: pronükleer göç (0-5:45), asimetrik ilk bölümü (6:45-14:45) ve asenkron ikinci lige (14:45-27:00). Veri 60x 1.35 NA lens ile toplanmıştır. 1 mikron aralıklarla 20 odak düzlemleri 40 μs maruz kalma ile her 15 saniyede toplanmıştır. Bu posterior, sağ ve ventral aşağı böylece Resimler döndürülemez. Ölçek Bar 10 mikron temsil eder.
Şekil 2 metafaz (C) anafaz iğ midzone görünen öncesine kadar erken anafaz kromozom üzerinde mevcut kromozom yolcu kompleks bir GFP etiketli subunit (HAVA-2) dinamik hareketler gösteren bir floresan film Stills sitokinez tamamlar (F C). Veri 60x 1.35 NA lens ile toplanmıştır. Tek bir odak düzlemli 50 μsec maruz kalma ile her 10 saniyede toplanmıştır. Böylece bu posterior sağ Resimler döndürülemez. Ölçek Bar 10 mikron temsil eder.
Wild-Tipi Embriyo Movie 1 Nomarski Film.
Şekil 1 tekabül eden bir film. Posterior, sağ ve ventral alt sol alt. Ayarlanır özgün veriler tek bir odak düzlemli gösterir. Image her 15 saniyede toplanmış ve oyun saniyede 14 kare hızla geri ayarlanır. video izlemek için buraya tıklayın
Movie 2 GFP ifade Wild-Type embriyo Floresan Film: AIR-2.
Şekil 2 tekabül eden bir film. Posterior sağ üst etmektir. Film tek bir odak düzlemli olarak toplanmıştır. Image her 10 saniyede toplanmış ve oyun saniyede 14 kare hızla geri ayarlanır. video izlemek için buraya tıklayın
Discussion
Zaman atlamalı canlı görüntüleme için önemli bir husus, hücre ve organizmanın bütünlüğü ve canlılığını korumak için. DIC mikroskopi örnek aydınlatma kaynağı ultraviyole ışık ve aşırı ısıtma maruz kalmayacağı bir yarar sağlar. DIC mikroskopi hücre gibi sitokinez olarak göç ve hücre şekil değişiklikleri de algılamak ve mitotik iğsi ve nükleer membran gibi bazı hücre içi yapıları tanımlamak için uygundur. Muhabir proteinlerin floresan görüntüleme ek hücre içi bölmeleri belirlenmesi ve spesifik proteinlerin görselleştirme izin DIC mikroskopi tamamlar. Fototoksisite ve floresan görüntüleme sırasında embriyo zarar tehlikeleri azaltmak için, genellikle düşük UV ışık şiddeti ve aydınlatma süresi ofset dijital kamera kazancı artırmak. Soluk floresan transgenik gazetecilere arka plan çekilen görüntülerin kalitesini artırmak için, deconvolution algoritmalar azaltmak için odak-ışık veya deblurring algoritmaları yeniden atamak için. Konfokal veya multiphoton sistemleri gibi gelişmiş mikroskoplar bazen gerekli olsa da, çok sayıda floresan gazetecilere bu epifluorescent mikroskop kurulum kullanarak, yüksek kaliteli görüntüler alındı görüntülü olabilir bulduk.
Micro-Yöneticisi (http://www.micro-manager.org), ücretsiz olmasının yanı sıra, doğrudan tiff formatında dosyalar yerine, birçok ticari yazılım paketleri özel dosya formatlarını kaydeder. Bu önemli ölçüde ImageJ, Photoshop ve diğer resim düzenleme yazılımı görüntü dosyalarını okumak için gerekli olan dosya dönüştürme adım ortadan kaldırarak veri analizleri kolaylaştırır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
İç kurumsal fonlar ve Michigan Üniversitesi Biyolojik Bilimler Alimler Programı, bu çalışmaları destekledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses | Olympus Corporation | ||
| Micro-Manager 1.3.46 | Micro-Manager | http://www.micro-manager.org | |
| Image J 1.43 | http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| loci_tools.jar | http://www.loci.wisc.edu | ||
| Agarose - molecular biology/gel electrophoresis grade | |||
| Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 15-901 | |
| 18 mm x 18 mm #1.5 coverslips | |||
| M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4) | |||
| (http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm). | |||
| Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25. | |||
| Vaseline | |||
| Brush/Stick | |||
| Razor blades | |||
| Heat block | |||
| Dissecting microscope | |||
| Worms22 | |||
| Platinum wire pick22 | |||
| 27G1/2 Precision Glide Needle or a scalpel with a small blade | BD Biosciences |
References
- Gerlich, D., Koch, B., Dupeux, F., Peters, J. M., Ellenberg, J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 16, 1571-1578 (2006).
- Nabeshima, K. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9, 3211-3225 (1998).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 100, 64-119 (1983).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Heuvel, S. vanden Cell-cycle regulation. WormBook. , 1-16 (2005).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Gonczy, P., Rose, L. S. Asymmetric cell division and axis formation in the embryo. WormBook. , 1-20 (2005).
- Nance, J., Lee, J. Y., Goldstein, B. Gastrulation in C. elegans. WormBook. , 1-13 (2005).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- O'Connell, K. F., Leys, C. M., White, J. G. A genetic screen for temperature-sensitive cell-division mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 149, 1303-1321 (1998).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [see comments]. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Jansen, G., Hazendonk, E., Thijssen, K. L., Plasterk, R. H. Reverse genetics by chemical mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 17, 119-121 (1997).
- Liu, L. X. High-throughput isolation of Caenorhabditis elegans deletion mutants. Genome Res. 9, 859-867 (1999).
- Bazopoulou, D., Tavernarakis, N. The NemaGENETAG initiative: large scale transposon insertion gene-tagging in Caenorhabditis elegans. Genetica. 137, 39-46 (2009).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 5, 3484-3496 (1985).
- Piano, F., Schetter, A. J., Mangone, M., Stein, L., Kemphues, K. J. RNAi analysis of genes expressed in the ovary of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1619-1622 (2000).
- Gonczy, P. Functional genomic analysis of cell division in C. elegans using RNAi of genes on chromosome III. Nature. 408, 331-336 (2000).
- Sonnichsen, B. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 434, 462-469 (2005).
- Mohler, W. A., Isaacson, A. B. Imaging embryonic development in Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Bembenek, J. N. Cortical granule exocytosis in C. elegans is regulated by cell cycle components including separase. Development. 134, 3837-3848 (2007).
- Poteryaev, D., Squirrell, J. M., Campbell, J. M., White, J. G., Spang, A. Involvement of the actin cytoskeleton and homotypic membrane fusion in ER dynamics in Caenorhabditis elegans. Mol Biol Cell. 16, 2139-2153 (2005).
- Bianchi, L., Driscoll, M. Culture of embryonic C. elegans cells for electrophysiological and pharmacological analyses. WormBook. , 1-15 (2006).
