市販<em> C.エレガンス</em>胚は、細胞生物学と開発を研究するための強力なシステムです。我々はのライブイメージングのためのプロトコルを提示<em> C.エレガンス</em>容易に入手できる落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用してDIC光学系や蛍光を利用した胚。
このような染色体の組み立て、偏析や細胞質分裂などの細胞プロセスは、本質的に動的です。蛍光標識レポータータンパク質または微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いた生細胞のタイムラプスイメージングが、そうでない場合は、固定サンプル1,2の分析から推論されるこれらの動的なイベントの時間的進行の検査が可能になります。また、細胞プロセスの開発規制の研究は、開発中に無傷の生物にタイムラプス実験を必要とする。 Caenorhabiditis elegansの胚は、このように4,5と開発6月9日細胞生物学の質問を研究するための理想的な実験モデルを提供する、光透過的であり、3系統知られている細胞と急速な、不変の発生プログラムを持っています。C.は虫は前進遺伝学(ランダム変異誘発10,11に基づいて)と特定の遺伝子を標的とする逆遺伝学(RNAiによる干渉に基づいており、変異導入12月15日を対象)で遺伝子操作に修正可能です。さらに、トランスジェニック動物が容易に蛍光タグタンパク質や記者16,17を表現するために作成することができます。これらの特性はそれが容易にin vivoで 18から21 に基本的な細胞や発生過程を制御する遺伝的経路を識別できるように組み合わせる。このプロトコルでは、Cのライブイメージングのための方法を提示化合物落射蛍光顕微鏡でDIC光学系やGFPの蛍光を用いて線虫の胚。我々は通常、固定サンプルのイメージングに使用容易に利用できる顕微鏡が、、また、イメージングプロセスを自動化するオープンソースのソフトウェアを使用してタイムラプス解析に適用することができる容易さを示しています。
ライブタイムラプスイメージングのための主要な考慮事項は、細胞や生物の完全性と実行可能性を維持することです。 DIC顕微鏡は、試料を照明光源からの紫外線や過度の加熱にさらされていないことの利点を提供します。 DIC顕微鏡は、よく細胞遊走や細胞質分裂などの細胞の形状変化を検出し、そのような有糸分裂紡錘体や核膜などのいくつかの細胞内構造を、識別するために適しています。レポータータンパク質の蛍光イメージングは、追加の細胞内コンパートメントを特定し、特定のタンパク質の可視化を可能にすることによってDIC顕微鏡を補完します。蛍光イメージングの間に胚に光毒性と被害の危険性を軽減するために、我々は、通常照明の削減のUV光の強度と持続時間を相殺するためにカメラのデジタルゲインを増加させる。微弱な蛍光トランスジェニックレポーターのために、バックグラウンドを減らすために焦点のずれた光やぼけ修正アルゴリズムを再割り当てするデコンボリューションアルゴリズムにより、撮影した画像の品質を向上させることができます。このような共焦点顕微鏡や多光子システムなどの高度な顕微鏡は、時々必要であるが、我々は高品質な画像をもたらし、多くの蛍光レポーターがこの落射蛍光顕微鏡のセットアップを使用して画像化することができることを見出した。
マイクロマネージャーは(http://www.micro-manager.org)、無料であることに加えて、代わりに多くの商用ソフトウェアパッケージの独自のファイル形式のTIFF形式への直接ファイルを保存します。これは大幅にImageJを、Photoshopや他の画像編集ソフトで画像ファイルを読み込むために必要なファイルの変換ステップを排除することによって私たちのデータの分析を簡素化します。
The authors have nothing to disclose.
内部の制度資金とミシガン大学の生物科学の奨学金プログラムは、この作業を支持した。
Olympus BX61 microscope with Hamamatsu Orca-ER camera. 10x Plan Fluorite (NA 0.3) and 60x PlanAchromat (NA 1.35) objective lenses
Micro-Manager 1.3.46(http://www.micro-manager.org)
Image J 1.43 (http://rsbweb.nih.gov/ij)
loci_tools.jar (http://www.loci.wisc.edu)
Agarose – molecular biology/gel electrophoresis grade
Fisher Superfrost/Plus Microscope Slides (Catalog # 12-550-15)
Laboratory tape (Fisher Catalog # 15-901 Series)
18 mm x 18 mm #1.5 Coverslips
M9 (242 mM KH2PO4, 40 mM Na2HPO4, 9 mM g NaCl, 19 mM NH4Cl MgSO4)
(http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm).
Egg Buffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH 7.3)25.
Vaseline
Brush/Stick
Razor blades
Heat block
Dissecting microscope
Worms22
Platinum wire pick22
27G1/2 Precision Glide Needle (Beckton Dickinson) or a scalpel with a small blade