Summary
Kennis van het exacte aantal levensvatbare cellen is nodig voor vele weefselkweek manipulaties. Dit protocol beschrijft hoe onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren cellen met behulp van een hemacytometer. Hoewel het beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), kan het worden gebruikt voor andere celtypen.
Abstract
Kennis van het precieze aantal levensvatbare cellen in een bepaald volume van een celsuspensie is vereist voor veel routine weefselkweek manipulaties, zoals plating cellen voor immunocytochemie of voor de cel transfecties. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en snelle methode om onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren van de cel concentratie en het totale aantal cellen met behulp van een hemacytometer. Deze procedure vereist in de eerste losmaken cellen van een groei oppervlak en resuspenderen ze in de media. Vervolgens worden de cellen verdund in een oplossing van trypan blauw (ideaal om een concentratie die geeft 20 tot 50 cellen per kwadrant) en geplaatst in de hemacytometer. Ten slotte is het gemiddelde van de tellingen van levensvatbare cellen in een aantal willekeurig geselecteerde kwadranten, de verdeling van de gemiddelde door het volume van een 1 mm 2 kwadrant (0,1 pi) en te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor geeft het aantal cellen per liter Vermenigvuldigen deze cel de concentratie van het totale volume in ui geeft het totaal aantal cellen. Dit protocol beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), maar kan ook gebruikt worden voor vele andere celtypes.
Protocol
Passage menselijke neurale stamcellen
Let op: Raadpleeg de passage menselijke neurale stamcellen artikel over hoe je los te maken en resuspendeer de cellen. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
De voorbereiding van de celsuspensie voor tellen
- Plaats 25 pi van 0,4% trypan Blue oplossing en 20 pl van de cel media in een eppendorfbuisje.
- Resuspendeer de cellen worden geteld door zachtjes te tikken op de buis met de cellen in een bekend volume van de media om een homogene suspensie te creëren. Plaats 5 ul van cellen in de eppendorfbuisje uit de vorige stap. Deze stap verdunt de cel concentratie met een factor 10.
- Plaats het deksel glas op de hemacytometer, en de belasting ongeveer 11-12 pi van de celsuspensie.
Het tellen van cellen in de hemacytometer
- Let op de gehele rooster van de hemacytometer in een fase contrast microscoop. Focus op een kwadrant van het net (zoals het een in het rood).
- Dode of stervende cellen zal verschijnen blauw omdat hun membraan is beschadigd en zijn niet in staat om de trypan blauwe kleurstof uit te sluiten. Levensvatbare cellen verschijnt niet blauw en wordt omringd door een "halo" van het licht in fase-contrast (zal worden "phase-bright").
- Tel het aantal levensvatbare cellen in een kwadrant (gebied 1 mm 2). U kunt de levensvatbaarheid van de cellen ook bepalen door het aantal levensvatbare cellen door het totaal aantal cellen. Tellen cellen in 3-4 willekeurige kwadranten en bepalen het gemiddelde aantal cellen per kwadrant. Omdat het volume van een kwadrant is bekend dat 10 -4 ml of 0,1 ul worden, kan de concentratie van de cellen wordt bepaald
- U kunt gebruik maken van de volgende snelkoppeling naar de # cellen / ul te bepalen:
Totaal aantal cellen in buis = # cellen / ul X ul in tube
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en snelle manier is om de cel concentratie te bepalen voor een verscheidenheid van experimenten met cellen. Met behulp van de snelkoppeling beschreven in 3d, kan men snel en nauwkeurig bepalen van de cel concentratie en het totale aantal cellen in een bepaald volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel erkennen bij de Children's Hospital, Orange County Instituut voor het verstrekken van hNSPC culturen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
