Summary
يمكن أن تكون ذبابة الفاكهة الخصيتين melanogaster بسرعة وبكفاءة معزولة من الذكور البالغين باستخدام الإبر تشريح. مع الممارسة ، يمكن للمرء بسهولة في عزل واحد أو يومين مبلغ الخصيتين كافية لتحليل الحمض النووي الريبي أو عن طريق التسلسل إنتاجية عالية أو أكثر من الطرق التقليدية أو البيولوجيا الجزيئية للبروتين للفحوصات الأجسام المضادة أو الانزيم المستندة.
Abstract
الخصيتين من melanogaster ذبابة الفاكهة توفر نموذجا هاما لدراسة صيانة الخلايا الجذعية والتمايز ، الانقسام الاختزالي ، والتفاعلات ، germline سوما. عادة ما يتم عزل الذكور البالغين من الخصيتين 0-3 أيام بعد eclosion من القضية العذراء. تتميز بسهولة الخصيتين البرية من نوع الذباب من الأنسجة الأخرى لأنهم الصفراء ، ولكن الخصيتين من الذباب الأبيض متحولة ، على خلفية مشتركة الوراثية للتجارب معملية مماثلة في كل من الشكل واللون على الوتر الطيران. أداء تشريح على شريحة ميكروسكوب زجاجية مع خلفية سوداء يجعل التعرف على الخصيتين أسهل بكثير. تتم إزالة الخصيتين من الذباب باستخدام الإبر تشريح. بالمقارنة مع البروتوكولات التي تستخدم ملقط لتشريح الخصيتين ، اسلوبنا هو أسرع بكثير ، مما يسمح للفرد يمارس جيدا لتشريح الخصيتين من الذباب البري من نوع 200-300 في الساعة ، مما أسفر عن 400-600 الخصيتين. الخصيتين من الذباب الأبيض أو من المسوخ التي تقلل من حجم الخصيتين هي أصعب لتشريح وتسفر عادة 200-400 الخصيتين للساعة الواحدة.
Protocol
- جعل شريحة المجهر والزجاج مع خلفية سوداء : قص 20 ورقة بيضاء # لنفس حجم الشريحة المجهر. لون جانب واحد من الورق الأسود بحجم الشريحة باستخدام علامة دائمة (على سبيل المثال ، Sharpie). تطبيق الغراء الأبيض (إلمر) إلى الجانب الأسود والالتزام ورقة إلى الشريحة. ويمكن إعادة استخدام الشرائح. ¾ باستخدام "شريط التسمية (Fisherbrand) ، تأمين شريحة المجهر ، والجانب الزجاج ، وصولا الى منصة يطير CO 2 إلى الإصلاح في مكانه.
- جمع الذباب 0-3 اليوم الذكور القديمة.
- إعداد دلو من الجليد ، والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، والإبر تشريح.
- تخدير 5-10 الذباب باستخدام دفق من ثاني أكسيد الكربون (2) ونقلها من الزجاجة أو القارورة إلى لوحة تطير بالقرب من شريحة المجهر.
- ماصة ~ 50 ميكرولتر الجليد الباردة PBS في الانخفاض في منتصف شريحة المجهر.
- اختيار برفق حتى ذبابة الذكور مع إبرة تشريح وتراجع إبرة تشريح في برنامج تلفزيوني ، لمسة رقيقة الجانب البطني (أي بالقرب من أجنحة) من يطير مع أنها مكان الإبرة في قطرة من برنامج تلفزيوني.
- إبرة مكان واحد في منتصف الذبابة ، وبين الصدر والبطن ، والتي أدت الى تراجع بشدة. مكان الإبرة الأخرى بين السادسة (A6) والسابعة (A7) شرائح البطن (المشارب الثاني والثالث من القاع) ؛ سحب البطن بعيدا عن الصدر.
- ندف الخصيتين وبصرف النظر عن الأجهزة الأخرى ، وخاصة في القناة الهضمية. ولا سيما في المسوخ الأبيض ، الخصيتين والأمعاء مشابها. الاختلافات الأساسية هي أن الخصيتين تأتي دائما في أزواج ، كل خصية ولولبي ، وأكثر من اللون الأبيض في الأمعاء.
- تخزين الخصيتين في الجليد الباردة PBS في أنبوب microcentrifuge البولي بروبلين.
ممثل النتائج :
الشكل 1. الظهرية رأي الجهاز التناسلي الذكري ، من flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase الإسناد :... "بعد 38 A على الشكل صفحة 508 من ميلر (1950) ألف ميلر وعلم التشريح والأنسجة الداخلية لليافعة من melanogaster ذبابة الفاكهة في M. Demerec والمحرر ، وبيولوجيا ذبابة الفاكهة ، الفصل 6 ، صفحات 420 -- 534. الباردة الربيع هاربور مختبر الصحافة ، الطبعة الفاكس ، 1994. حقوق الطبع والنشر 1994 من قبل الصحافة الربيع الباردة مختبر هاربور. مستعملة بإذن نوع من مختبر كولد سبرنغ هاربور (CSHL) الصحافة. انظر http://www.cshlpress.com ".
Discussion
ونحن نقدم على بروتوكول لعزل الخصيتين melanogaster ذبابة الفاكهة من الكبار من الذكور. لأن هذه التقنية تتطلب تنسيق واحد اليدين ، ومهارة لا يأتي إلا مع الممارسة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
المؤلفان بالشكر Vasia الغمد لإدخال هذه التقنية في المختبر لدينا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
