Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Summary

Questo articolo precisa le procedure necessarie per l'iperespressione e l'analisi delle piccole GTPasi in cellule epiteliali polarizzate usando la tecnica microiniezione.

Abstract

Le cellule epiteliali polarizzare la loro membrana plasmatica in domini apicale e basolaterale biochimicamente e funzionalmente distinti in cui il dominio apicale si affaccia sul 'libero' delle superfici e la membrana basolaterale è in contatto con il substrato e le cellule vicine. Entrambi i domini di membrana sono separati da giunzioni strette, che formano una barriera alla diffusione. Apicale-basolaterale polarizzazione può essere riassunta con successo in coltura quando le cellule epiteliali, come Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) sono teste di serie ad alta densità su filtri in policarbonato e coltivate per diversi giorni ^{1 2.} Creazione e mantenimento di polarità delle cellule è regolata da una serie di piccole GTPasi della superfamiglia Ras come Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 e Rab13 ^{3 4 5 6 7.} Come tutte le GTPasi queste proteine ​​ciclo tra un inattivo PIL legato Stato e un attivo GTP-bound stato. Specifiche mutazioni nelle regioni nucleotide binding interferire con questo ciclismo ^8. Per esempio, Rab13T22N è permanentemente bloccato nella forma del PIL e quindi soprannominato 'dominante negativo', mentre Rab13Q67L non può più idrolizzare GTP e quindi è bloccata in uno stato 'dominante attivo' ^7. Per analizzare la loro funzione nelle cellule entrambi gli alleli dominanti negativi e dominante attiva della GTPasi sono tipicamente espressa ad alti livelli di interferire con la funzione delle proteine ​​endogene ^9. Un modo elegante per raggiungere elevati livelli di overespressione in un breve lasso di tempo è quello di introdurre i plasmidi codifica le proteine ​​pertinenti direttamente nei nuclei delle cellule coltivate su filtro polarizzato supporta l'utilizzo di tecnica microiniezione. Questo è spesso combinata con la co-iniezione di plasmidi reporter che codificano recettori di membrana plasmatica che sono specificamente ordinati al dominio apicale o basolaterale. Un carico di frequente utilizzato per analizzare carico ordinamento al dominio basolaterale è un allele sensibile alla temperatura del virus della stomatite vescicolare glicoproteina (VSVGts045) ^10. Questa proteina non può piegare correttamente a 39 ° C e sarà quindi mantenuto nel reticolo endoplasmatico (ER), mentre la proteina regolatrice di interesse è assemblata nel citosol. Uno spostamento a 31 ° C, quindi consentire VSVGts045 piegare correttamente, lasciare il Pronto Soccorso e viaggiare alla membrana plasmatica ^11. Questa caccia viene di solito effettuata in presenza di cicloesimide per evitare ulteriori sintesi proteica che porta a ottenere risultati più nitidi. Qui si descrivono in dettaglio la procedura di microinjecting plasmidi in cellule polarizzate e successive incubazioni compresi turni di temperatura che permettono una analisi completa delle proteine ​​regolatrici coinvolte nella selezione basolaterale.

Protocol

1. Isolamento del DNA plasmidi

1. Utilizzare un Sigma-Aldrich privo di endotossine maxiprep kit per la preparazione del DNA libero endotossina secondo il protocollo del produttore. Questo kit funziona per noi, perché rimuove in modo efficace qualsiasi endotossine da preparazioni di DNA. Endotossine che vengono iniettati con il DNA nei nuclei delle cellule porterà alla morte cellulare.
2. Aggiungere 100 ul fenolo / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) al DNA isolato, vortice e gira per 1 minuto a 13.000 giri al minuto in una microcentrifuga Eppendorf. Trasferire la fase superiore acqua in un nuovo tubo e aggiungere 100 ul cloroformio / isoamylalcohol (24:1), vortice e spin come sopra. Trasferire la fase superiore acqua contenente il DNA in una nuova provetta. Questo passaggio è necessario per rimuovere qualsiasi proteina dal DNA, che impedisce l'intasamento dell'ago microiniezione.
3. Precipitare il DNA con l'aggiunta di acetato di sodio (pH 6.0) ad una concentrazione finale di 300 mm e 2 X etanolo 100% vol. Incubare a -20 ° C durante la notte. Spin DNA per 20 minuti a 13.000 rpm in una microcentrifuga Eppendorf, lavare una volta con etanolo al 70%, e risospendere in 300 ml d'acqua privo di endotossine (Sigma-Aldrich).
4. Determinare la concentrazione di DNA. Una concentrazione di DNA tipico varia da 1 a 5 mcg / mL.

2. Coltura di cellule MDCK

1. Dividere le celle MDCK. Contare le celle e semi di 4 x 10 ⁵ cellule chiare sul 12-mm filtri Transwell (0,4 micron dimensione dei pori, Corning Costar, 3460). Per un esperimento di controllo che contiene un mock-iniezione e di due diverse proteine ​​Rab mutante è necessario seme tre filtri.
2. Cellule in coltura MDCK medio MEM con 2 mM L-glutammina, 0,1 mg / ml di penicillina / streptomicina e il 7% (v / v) siero fetale bovino (= supporto della crescita MEM) a 37 ° C e 5% di CO _2.
3. Modifica dei media nella camera di basolaterale ogni giorno. Questo aiuta il processo di polarizzazione, perché imita la situazione delle cellule epiteliali negli animali.
4. 2 giorni dopo la semina il check-in un microscopio se le cellule sono in crescita in un monostrato chiuso. Se non è possibile rilevare eventuali buchi nella monostrato, eseguire l'esperimento il giorno 3. Se ci sono ancora buchi, eseguire l'esperimento il giorno 4.

3. Microiniezione Procedura e post-iniezione incubazioni

1. Il giorno dell'esperimento preparare 5 ml terreni di coltura MEM più 50 HEPES mM in una piastra 60 x 15 mm per ogni filtro e posto in un incubatore a 39 ° C. Inoltre, impostare un bene di un 12-pozzetti con 1 ml di terreno di coltura MEM più 50 HEPES mM e 0,1 mg / ml cicloesimide per filtro, e posto in un incubatore 31 ° C.
2. Accendere il microscopio microiniezione e impostare il suo stadio riscaldato a 39 ° C. Usiamo un microscopio invertito (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc.) con una fase di riscaldamento, gli obiettivi 10X e 32X e un FemtoJet Eppendorf (InjectMan NI2). Infine, aprire il serbatoio di azoto che fornisce il tavolo aria con azoto.
3. Diluire il DNA con acqua filtrata (l'uso del filtro 0,2 micron) ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml in un volume totale di 10 - 100 l. Successivamente, rotazione del DNA in microcentrifuga Eppendorf a 13.000 rpm per 30 min. Rimuovere parte superiore e mettere in un nuovo tubo. Questa fase assicura che quando si carica il vostro DNA diluito in microiniezione l'ago si può caricare con precisione il DNA "pulita". Il vostro DNA è ora pronto per microiniezione.
4. Preparate le vostre cellule estrapolando il primo filtro della sua capsula di Petri. Con una lama chirurgica (Blade Feather chirurgico, acciaio inox, n. 11), tagliare il filtro dal porta filtro e il luogo in 5 ml, 39 ° C caldo terreni di coltura MEM HEPES più 50 mm (60 x 15 mm Piastra). Appesantire il filtro nella piastra di coltura con la lama chirurgica utilizzata per tagliare fuori. Posizionarlo sul filtro tale che il foro della lama chirurgica circonda il centro del filtro. Inserisci la tua piastra di coltura sul palco riscaldato del microscopio.
5. 2-3 ml di carico vostro DNA diluito (in questo caso la codifica plasmidi VSVGts045-GFP controllo iniezione = finta) in un ago da microiniezione (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), ruotare il coperchio di protezione dell'ago e lasciarlo cadere a terra . Ora l'ago è pronto per essere avvitato nel relativo supporto. Per farlo, premere il tasto menu del vostro InjectMan e assicurarsi che la valvola è chiusa. Avvitare l'ago nel relativo supporto, fai attenzione a non avvitare l'ago troppo stretto come che possono portare alla rottura. Ora, premere il tasto Menu di nuovo, il applicata P _c impedisce ai media di essere risucchiati l'ago durante la procedura microinjeciton. Infine, toccare il joystick per cancellare homing memorizzati.
6. Per abbassare l'ago sulla cellule, utilizzare l'obiettivo 10X e portare l'ago nel fascio di luce al di sopra del liquido. Ora concentrarsi sulle cellule, portare l'attenzione di nuovo girando la ruota di fuoco a 180 °, e trovare l'ago. In seguito, lentamente spostare l'ago a fuoco, quindi portare fuori fuoco ancora una volta (lavorando per portare le cellule a fuoco ancora una volta), far scendere l'ago in percus di nuovo. Ripetere fino a quando l'ago tocca la superficie del supporto, a quel punto tutto quello che vedrete è un alone. Quando si raggiunge un punto in cui le cellule sono a fuoco, ma l'ago è ancora sfocata (cioè fuori dal piano focale) modifica l'obiettivo 32X e fine impostazioni grossolana.
7. Impostare il z-limite toccando la membrana apicale con la punta dell'ago e sottraendo circa 10 micron, come i nuclei che sono circa 10 micron al di sotto della membrana apicale.
8. Dopo aver impostato la z-limite, la giusta pressione di iniezione. Inizio a 95 PSI. Se la pressione è troppo alta, le cellule farà saltare in aria. Se la pressione è troppo bassa, si vedrà un puntino bianco che rimane, ma non succede nient'altro. Con una iniezione di successo, si vedrà un cambiamento di fase, senza un cambiamento di dimensione delle celle. Per l'iniezione, portare l'ago di un paio di micron fuori del piano focale il più velocemente possibile. Puntare con l'ago al di sopra del nucleo (ovvero la metà di una singola cella) e premere il pulsante di iniezione del joystick, ma non tenere premuto il pulsante.
9. Iniettare 100-500 cellule all'interno del foro della vostra lama chirurgica che giace sulle vostre cellule. Quando hai finito, inserire il vostro cellule con il piatto la cultura e la lama chirurgica in un incubatore 39 ° C, e incubare per 2 ore Durante questo periodo, VSVGts045-GFP è espressa e secreta nel ER. Tuttavia, a 39 ° C, VSVGts045-GFP non può piegare correttamente e quindi non può lasciare il Pronto Soccorso. Nel frattempo, la piccola GTPasi di interesse si accumula nel citosol in co-iniezione esperimenti.
10. Dopo 2 h, posto le cellule in 1 ml di terreno di coltura MEM più 50 HEPES mM e 0,1 mg / ml cicloeximide in un 12-pozzetti ed incubare per 2 ore a 31 ° C. Durante questo periodo di caccia, VSVGts045-GFP si piega correttamente, lasciare il pronto soccorso e viene consegnato alla superficie cellulare.
11. Ripetere i passaggi 3,1-3,10 per filtri due (iniettare plasmidi codifica VSVGts045-GFP e, per esempio V5-tagged Rab13T22N) e tre (iniettare plasmidi codifica VSVGts045-GFP e, per esempio V5-tagged Rab13Q67L). Ogni iniezione di circa 20 - 60 min. Tuttavia, è assolutamente cruciale per il trattamento di ogni filtro stesso modo in tutta incubazioni spostare la temperatura e la colorazione della superficie fino a fissare le cellule. Dopo la fissazione, è possibile eseguire il resto della tua protocollo di colorazione per tutti i filtri al tempo stesso.

4. La colorazione della superficie per l'analisi di immunofluorescenza

Nota, in modo da evitare lo sbiancamento del segnale della GFP VSVGts045-GFP, proteggere i campioni dalla luce coprendo con un foglio di alluminio durante tutte le procedure successive.

1. Se si desidera procedere alla colorazione della superficie, luogo vostre cellule in una capsula di cultura su una lastra di metallo su ghiaccio e lavarsi le cellule 1X PBS freddo con ghiaccio ^{2 +} (PBS [0,2 g / litro di KCl, 0,2 g / litro KH ₂ PO _4, 8 g / litro di NaCl e 2,17 g / litro Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O] oltre 0,1 g / litro CaCl ₂ e 0,1 g / litro MgCl ₂ x 6 H ₂ O). Successivamente, versare 30 ml di un anticorpo che riconosce la ectodomain della vostra proteina, in questo caso il mouse TK1 anticorpo monoclonale (IgG _1, ottenuto dalla fine Thomas Kreis), su parafilm pulito posizionato sulla piastra di metallo sul ghiaccio. Posizionare il filtro con le vostre cellule a testa in giù sul menu e aggiungere alcune gocce di anticorpi sul retro del filtro. Incubare per 1 h sul ghiaccio.
2. Cellule posto in un 12-pozzetti, lavare 3 volte con PBS freddo ghiaccio ^{2 +} (o RT caldo PBS ^{2 +} senza colorazione superficie prima), e fissare con il 3% paraformaldeide per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare le cellule una volta con PBS ^{2 +} e lasciare in PBS ^{2 +} per 5 min.
4. Incubare cellule nel bloccare / buffer permeabilizzazione (BPB) (2% [peso / volume] BSA, 0,4% [peso / volume] saponina in PBS ^{2 +)} con il 10% [vol / vol] siero di capra. Incubare 1 ora a temperatura ambiente.
5. Diluire gli anticorpi primari per rilevare l'espresso Rab GTPasi, in questo esempio anti-V5 (topo monoclonale IgG _2a, Invitrogen), 1:200 in BPB. Spin anticorpi diluita in una microcentrifuga Eppendorf per 10 minuti a 13.000 giri al minuto. Versare 30 ml di soluzione di anticorpi su parafilm pulita posto in una camera umida. Posizionare le celle filtro a testa in giù sul calo degli anticorpi e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Cellule posto posteriore (fino a destra) in un 12-pozzetti e lavare 5 volte oltre 30 minuti con BPB a temperatura ambiente.
7. Diluire appropriati anticorpi secondari, in questo caso di capra anti-topo IgG ₁ Alexa 594-etichetta (per VSVG rilevamento in superficie, Invitrogen) e Cy5-etichettati anticorpi secondari di riconoscere il vostro GTPasi Rab, in questo esempio di capra anti-topo IgG _2a Cy5 marcato (ImmunoResearch Jackson), 1:200 in BPB e spin come sopra. Si introducono 30 microlitri soluzione di anticorpi su parafilm pulita in una camera umida e cellule luogo il filtro a testa in giù sul calo degli anticorpi. Incubare 1 ora a temperatura ambiente.
8. Ripetere il punto 4.6.
9. Dip cellule su filtro 3X in acqua deionizzata e luogo rverso l'alto ight su microslides. Aggiungere 10-15 microlitri di montaggio (10% [peso / volume] DABCO, 50% [peso / volume] glicerolo in acqua distillata) sulla parte superiore delle celle. Luogo 18x18 millimetri di vetro di copertura micro sulla parte superiore e utilizzando tessuti facciali premere delicatamente il coperchio sul bicchiere micro cellule. Sigillare con smalto.
10. Analizzare i campioni con un microscopio confocale. Abbiamo usato un Microsystem LSM 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc. che era dotata di un obiettivo 63x immersione in acqua.
11. Per la preparazione di figure, regolare e combinare immagini utilizzando programmi come Adobe Photoshop e Adobe Illustrator.

5. Rappresentante Risultati

Per esempi su come la co-espressione di piccole GTPasi interferisce con VSVG ordinamento gentilmente si riferiscono ad articoli pubblicati sia per missorting apicale ^{3, 4} o inibizione di consegna superficie ^7.

Figura 1. Nel finto-iniezione, cioè una iniezione di solo il plasmide codifica VSVGts045-GFP, la proteina viene consegnato alla superficie basolaterale delle cellule MDCK ben polarizzato come giudicato dalla colorazione della superficie (in rosso, figura 1 A). Si noti che non tutti i VSVGts045-GFP viene consegnato alla membrana basolaterale durante la caccia a 31 ° C, come evidenziato dal segnale intracellulare ampio per la proteina totale (in verde, figure 1 A e B). Nelle cellule che non sono ben polarizzato VSVGts045-GFP sarà consegnato anche alla membrana apicale (Figura 1 B). Se il vostro campioni di controllo simile alla cellula nella Figura 1 B, non ti puoi fidare dei dati e necessario ripetere l'esperimento con più polarizzato cellule. Barre di scala sono 5 micron.

Discussion

Le fasi più critiche per un esperimento di microiniezione di successo sono la qualità e la purezza del DNA e la polarità delle cellule. Senza cellule polarizzate, il controllo iniezione sarà già mistargeted VSVG e l'esperimento non può essere utilizzato. Se il DNA è di scarsa qualità, il DNA può intasare l'ago dell'iniezione porta a scarsa o assente espressione della proteina desiderata a tutti. Inoltre, è consigliabile utilizzare i plasmidi di espressione che sono conosciuti per portare a livelli di alta espressione, come pRKV.

Se desiderate provare per l'ordinamento delle proteine ​​altre merci, i protocolli di temperatura turno può essere modificata. Ad esempio, per esprimere a bassa densità recettori delle lipoproteine, noi dobbiamo fare la microiniezione a 37 ° C seguita da un 1 ora di incubazione a 37 ° C, 4 ore a 20 ° C (ad arrestare il carico nel TGN) e 2 ore a 37 ° C in presenza di 0,1 mg / ml cicloeximide ad inseguire la proteina alla superficie. Per alcune proteine ​​come recettori Fc, il tempo di incubazione a 20 ° C può essere ridotta a 2 h dipende da quanto velocemente il vostro carico di proteine ​​è sintetizzata e viaggia attraverso la via secretoria. Per una descrizione dettagliata di incubazione che abbiamo usato per le proteine ​​cargo diversi vedono Nokes et al., 2008 ^7.

Infine, questo protocollo non può essere utilizzato solo per l'analisi delle piccole GTPasi, ma in teoria per tutte le proteine ​​o frammenti di proteine ​​che si sospetta possa avere una funzione in (polarizzato) la consegna di superficie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400