ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Summary

מאמר זה מפרט את ההליכים הכרוכים overexpression וניתוח של GTPases קטן בתאי האפיתל מקוטב באמצעות טכניקה microinjection.

Abstract

תאים אפיתל לקטב הממברנה הפלסמטית שלהם לתוך תחומים apical ו basolateral ביוכימית וברור תפקודית שם תחום apical פניהם 'חינם' משטחים את הממברנה basolateral נמצא במגע עם המצע לבין תאים שכנים. שני תחומים מופרדים על ידי קרום צמתים הדוקים, המהווים מחסום דיפוזיה. Apical-basolateral קיטוב ניתן סיכם בהצלחה בתרבות כאשר לתאי האפיתל כגון כליה מדין-דארבי כלב (MDCK) התאים זורעים בצפיפות גבוהה על מסנני פוליקרבונט בתרבית במשך כמה ימים ^{1 2.} הקמה ותחזוקה של הקוטביות בתא מוסדר על ידי מערך של GTPases קטן superfamily ראס כגון RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 ו Rab13 ^{3 4 5 6 7.} כמו כל החלבונים האלה GTPases מחזור בין המדינה התמ"ג הנכנס פעילים מדינה פעיל GTP הנכנס. מוטציות ספציפיות באזורים מחייב נוקלאוטיד להפריע זה רכיבה על אופניים ^8. לדוגמה, Rab13T22N נעול לצמיתות בצורה תוצר ועל כך לכינוי "דומיננטי שלילי", בעוד Rab13Q67L כבר לא יכול hydrolyze GTP ו נעול ולכן במצב "פעיל דומיננטי" ^7. כדי לנתח את תפקידם בתאים אללים דומיננטי פעיל הן שליליות הדומיננטי של GTPases באים לידי ביטוי בדרך כלל ברמות גבוהות להפריע לתפקוד של חלבונים אנדוגניים ^9. דרך אלגנטית להשיג רמות גבוהות של overexpression בסכום זמן קצר היא להציג את פלסמידים קידוד החלבונים הרלוונטיים ישירות לתוך הגרעינים של תאים בוגרים מקוטב על מסנן תומך באמצעות טכניקה microinjection. זה לעתים קרובות בשילוב עם הזרקת המשותפת של פלסמידים כתב המקודדים קולטנים הממברנה הפלסמטית כי ממוינות במיוחד לתחום apical או basolateral. המטען משמש לעתים קרובות כדי לנתח מטען מיון לתחום basolateral הוא אלל טמפרטורה רגיש של גליקופרוטאין וירוס שלפוחי stomatitis (VSVGts045) ^10. חלבון זה לא יכול להתקפל כראוי על 39 מעלות צלזיוס, ובכך להישמר ב reticulum endoplasmic (ER), ואילו חלבון הרגולציה של הריבית התאספו cytosol. לעבור 31 מעלות צלזיוס לאחר מכן לאפשר VSVGts045 להתקפל כראוי, לעזוב את ER ולנסוע הממברנה פלזמה ^11. מרדף זו מבוצעת בדרך כלל בנוכחות cycloheximide למנוע סינתזת חלבון נוספת מובילה לתוצאות הניקוי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את ההליך של microinjecting פלסמידים לתאים מקוטב incubations העוקבים לרבות משמרות טמפרטורה המאפשרים ניתוח מקיף של חלבונים רגולטוריים המעורבים מיון basolateral.

Protocol

1. בידוד של DNA פלסמיד

1. השתמש רעלן פנימי ללא סיגמא אולדריץ maxiprep ערכה להכנת דנ"א רעלן פנימי חינם על פי פרוטוקול של היצרן. ערכה זו עובדת בשבילנו, כי זה אמין מסירה את כל ההכנות אנדוטוקסינים מ-DNA. אנדוטוקסינים כי מוזרקים עם ה-DNA לתוך גרעין התא יגרום למוות התא.
2. הוסף 100 μl פנול / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) ל-DNA מערבולת מבודדים, ספין דקות 1 ב 13,000 סל"ד ב microcentrifuge Eppendorf. מעבירים את השלב העליון מים לתוך צינור חדשה ולהוסיף 100 כלורופורם μl / isoamylalcohol (24:1), מערבולת ספין לעיל. מעבירים את המים בשלב העליון המכיל את ה-DNA כדי צינור חדש. צעד זה נחוץ כדי להסיר כל חלבון ה-DNA, אשר מונע סתימת המחט microinjection.
3. להאיץ את ה-DNA על ידי הוספת Acetate Na (pH 6.0) לריכוז סופי של 300 מ"מ ו - 2 X אתנול כרך 100%. דגירה ב -20 ° C במשך הלילה. ספין DNA עבור 20 דקות בסל"ד 13,000 ב microcentrifuge Eppendorf, לשטוף פעם אחת עם 70% אתנול, ו resuspend רעלן פנימי ב-free 300 μl מים (סיגמא אולדריץ ').
4. קביעת ריכוז ה-DNA. ריכוז ה-DNA טיפוסי טווחי 1-5 מיקרוגרם / μl.

2. התרבות של תאים MDCK

1. פיצול תאים MDCK. ספירת תאים וזרעי 4 X 10 ⁵ תאים על 12 מ"מ מסננים ברור Transwell (0.4 מיקרומטר גודל הנקבוביות, קורנינג שחקן המשנה, 3460). עבור ניסוי הכולל הזרקת מדומה מלאה שני חלבונים שונים ראב מוטציה אתה צריך זרע שלושה מסננים.
2. התרבות תאים MDCK במדיום ממ עם 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.1 מ"ג / מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין ו -7% (כרך / כרך) בסרום שור העובר (= התקשורת ממ צמיחה) בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
3. שינוי התקשורת בתא basolateral מדי יום. זה מסייע בתהליך הקיטוב, כי זה מחקה את המצב של תאים אפיתל בבעלי חיים.
4. 2 ימים שלאחר זריעת לבדוק מיקרוסקופ אם התאים צומחים בשכבה סגור. אם לא ניתן לזהות כל החורים monolayer, לבצע את הניסוי ביום 3. אם יש עדיין חורים, לבצע את הניסוי ביום 4.

3. Microinjection נוהל הודעה הזרקת Incubations

1. ביום הניסוי להכין 5 ממ מ"ל צמיחה מדיה פלוס 50 mM HEPES באחד צלחת 60 מ"מ x 15 עבור כל מסנן ומקום לתוך 39 ° C חממה. בנוסף, הקימו באר אחת של צלחת 12-היטב עם 1 מ"ל התקשורת ממ צמיחה פלוס 50 HEPES מ"מ ו 0.1 מ"ג / מ"ל ​​cycloheximide לכל לסנן, מקום לכדי 31 מעלות צלזיוס חממה.
2. הפעל מיקרוסקופ microinjection שלך התפאורה מחומם שלה 39 ° C. אנו משתמשים במיקרוסקופ הפוכה (Axiovert 200, Carl Zeiss MicroImaging, Inc) עם במה מחוממת, מטרות 10X ו 32x, ו Femtojet Eppendorf (Injectman NI2). לבסוף, לפתוח את גז חנקן טנק שמספק את שולחן אוויר עם חנקן.
3. מדולל DNA עם מים מסוננים (0.2 מיקרומטר להשתמש במסנן) לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל ​​בנפח כולל של 10-100 μl. לאחר מכן, ספין-DNA microcentrifuge Eppendorf בסל"ד 13,000 למשך 30 דקות. הסרת החלק העליון מקום בצינור חדש. צעד זה מבטיח כי בעת טעינת ה-DNA שלך המדולל לתוך המחט microinjection אתה יכול לטעון DNA בצורה מדויקת "נקי". ה-DNA שלך מוכן כעת microinjection.
4. הכנת התאים על ידי לקיחת לסנן החוצה הראשון של צלחת תרבותה. בעזרת להב כירורגי (Blade נוצה כירורגי, נירוסטה, לא 11), לחתוך את מסנן מבעל המקום לסנן לתוך 5 מ"ל, 39 ° C חם צמיחה התקשורת ממ פלוס 50 HEPES מ"מ (60 x 15 מ"מ צלחת). להכביד את המסנן בצלחת תרבות בלהב כירורגי השתמשת לחיתוך זה. מניחים אותו על כזה מסנן את החור של להב כירורגי המקיף את האמצעי של המסנן. מניחים צלחת התרבות שלך לבמה מחומם של המיקרוסקופ.
5. טען 2-3 μl של ה-DNA שלך מדולל (בקידוד זה מקרה פלסמידים VSVGts045-GFP = שליטה מדומה הזרקה) לתוך מחט microinjection (Femtotip השנייה, Eppendorf, 930000043), לסובב את מכסה המגן של המחט ולתת לו ליפול על הרצפה . כעת המחט הוא מוכן להיות מוברג לתוך המחזק שלו. לשם כך, לחץ על מקש התפריט של injectman כדי לוודא את השסתום נסגר. בורג את המחט לתוך המחזק שלו, צריך להיזהר לא לדפוק את המחט חזק מדי כמו שעלולות להוביל שבירה. כעת, לחץ על מקש התפריט שוב, P ליישם _ג תמנע מדיה נשאב לתוך המחט במהלך ההליך microinjeciton. לבסוף, ברז ג'ויסטיק שלך למחוק ביות מאוחסן.
6. כדי להוריד את המחט על גבי התאים, להשתמש המטרה 10X ולהביא את המחט לתוך קרן האור מעל הנוזל. עכשיו להתמקד בתאים, להביא את הפוקוס שוב על ידי סיבוב גלגל פוקוס 180 מעלות למעלה, למצוא את המחט. לאחר מכן, לאט להזיז מחט לתוך להתמקד, ואז להביא מתוך התמקדות שוב (עובדים לקראת הבאת את התאים לתוך להתמקד שוב), להפיל מחט לתוך עבורcus שוב. חזור על הפעולה עד שהמחט נוגעת את פני השטח של התקשורת, ובשלב זה כל מה שאתה רואה זה הילה. כאשר אתם מגיעים לנקודה שבה התאים הם בפוקוס, אבל המחט היא עדיין מטושטשת (כלומר מן המטוס מוקד) שינוי המטרה 32x והגדרות גס בסדר.
7. הגדרת Z-להגביל ידי נגיעה קרום apical עם קצה המחט ואת הפחתת כ -10 מיקרומטר כמו הגרעינים מניחים כ 10 מיקרומטר מתחת קרום apical.
8. לאחר שתגדיר את מגבלת-z, למצוא את הלחץ הנכון זריקה. התחלה ב 95 PSI. אם הלחץ גבוה מדי, התאים שלך יתפוצץ. אם הלחץ שלך הוא נמוך מדי, תראו נקודה לבנה שנשאר, אבל שום דבר אחר לא קורה. עם זריקה מוצלחת, תראה שינוי פאזה ללא שינוי גודל התא. עבור הזריקה, להביא את המחט כמה מיקרונים מן המטוס מוקד כמה שיותר מהר. מטרת עם המחט מעל הגרעין (כלומר באמצע תא יחיד), ולחץ על כפתור הזריקה של הג'ויסטיק שלכם, אבל לא לחיצה ארוכה על לחצן למטה.
9. הזרק 100-500 תאים בתוך החור של להב כירורגי שלך שוכב על התאים שלך. כשתסיים, במקום בתאים שלך עם המנה תרבות להב כירורגי לתוך 39 ° C האינקובטור, דגירה של 2 ח במהלך תקופה זו, VSVGts045-GFP מתבטא מופרש לתוך חדר המיון. עם זאת, 39 ° C, VSVGts045-GFP לא יכול להתקפל כראוי ולכן לא יכול לעזוב את חדר המיון. בינתיים, GTPase קטן של הריבית להצטבר cytosol של שיתוף הזרקת ניסויים.
10. לאחר 2 שעות, במקום התאים שלך לתוך 1 מ"ל התקשורת ממ צמיחה פלוס 50 HEPES מ"מ ו 0.1 מ"ג / מ"ל ​​cycloheximide בצלחת 12-באר ו דגירה עבור 2 שעות ב 31 ° C. במהלך תקופה זו מרדף, VSVGts045-GFP יהיה לקפל כראוי, לעזוב את ER ו מועבר פני התא.
11. חזור על שלבים 3.1-3.10 עבור מסנני שני (להזריק פלסמידים קידוד VSVGts045-GFP ו-V5 למשל מתויג Rab13T22N) ושלושה (להזריק פלסמידים קידוד VSVGts045-GFP ו-V5 למשל מתויג Rab13Q67L). כל זריקה ייקח בערך 20-60 דקות. עם זאת, חשוב בהחלט להתייחס בכל דרך לסנן אותו לאורך כל המשמרת incubations טמפרטורה מכתים פני השטח עד שאתה לתקן את התאים. לאחר קיבוע, אתה יכול לבצע את שאר פרוטוקול מכתים שלך כל המסננים באותו זמן.

4. Surface מכתים לניתוח immunofluorescence

שים לב, כדי למנוע הלבנת של האות של ה-GFP VSVGts045-GFP, להגן על דגימות מן האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום במהלך כל ההליכים הבאים.

1. אם ברצונך לבצע מכתים השטח, המקום התאים בצלחת תרבות לצלחת מתכת על הקרח ולשטוף תאים 1X עם קרח קר PBS ^{2 +} (PBS [0.2 גר '/ ליטר KCl, 0.2 גר' / ליטר KH ₂ PO ₄ שלך, 8 גר '/ ליטר NaCl, ו 2.17 גר' / ליטר Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O] בתוספת 0.1 גר '/ ליטר CaCl ₂ ו - 0.1 גר' / ליטר MgCl ₂ x 6 H ₂ O). לאחר מכן, מקום 30 μl של נוגדן זה מזהה את ectodomain של החלבון שלך, במקרה זה את העכבר נוגדן חד שבטי TK1 (IgG _1, המתקבל המנוח תומס קרייס), על parafilm נקי דגש על צלחת המתכת על הקרח. הנח את המסנן עם תאים שלך הפוך על ירידה ולהוסיף כמה טיפות של נוגדן על הישבן של המסנן. דגירה עבור h 1 על הקרח.
2. תאים המקום לתוך צלחת 12-באר, לשטוף 3X עם קרח קר PBS ^{2 +} (או RT חם PBS ^{2 +} ללא מכתים לפני השטח), ולתקן עם paraformaldehyde 3% עבור 15 דקות ב RT.
3. שטפו תאים פעם עם PBS ^{2 +} ולהשאיר ב PBS ^{2 +} דקות 5.
4. דגירה תאים חסימת / חיץ permeabilization (גוש הפרמטרים BPB) (2% [wt / כרך] BSA, 0.4% [wt / כרך] saponin ב PBS ^{2 +)} עם 10% [כרך / כרך] בסרום עז. דגירה 1 ש 'ב RT.
5. מדולל נוגדנים העיקרית לזהות הביעו ראב GTPase, בדוגמה זו אנטי V5 (עכבר חד שבטיים נוגדנים IgG _2a, Invitrogen), 1:200 של גוש הפרמטרים BPB. ספין נוגדנים מדולל microcentrifuge Eppendorf במשך 10 דקות בסל"ד 13,000. מקום 30 μl של הפתרון נוגדן על parafilm נקי להציב בחדר רטוב. מניחים את התאים על מסנן הפוך על ירידה נוגדנים ואת דגירה של 1 ש 'ב RT.
6. המקום התאים בחזרה (עד צד ימין) לתוך צלחת 12-היטב ולשטוף 5X מעל 30 דקות עם גוש הפרמטרים BPB ב RT.
7. מדולל משני נוגדנים מתאימים, עז במקרה זה אנטי עכבר IgG ₁ אלכסה 594 שכותרתו (עבור VSVG זיהוי על פני השטח, Invitrogen), ו Cy5 שכותרתו נוגדנים משני להכיר GTPase ראב שלך, עז זה למשל אנטי עכבר IgG _2a Cy5 שכותרתו (ImmunoResearch ג'קסון), 1:200 לתוך גוש הפרמטרים BPB ספין לעיל. מקום 30 μl פתרון נוגדן על parafilm נקי בחדר רטוב ותאי מקום על הפוך מסנן מטה אל טיפת נוגדן. דגירה 1 ש 'ב RT.
8. חזור על שלב 4.6.
9. טובלים תאים 3X מסנן למים מקום deionized ו rבצד מעלה ight על microslides. הוסף 10-15 הר μl (10% [wt / כרך] DABCO, 50% [wt / כרך] גליצרול במים מזוקקים) על גבי התאים. 18X18 מ"מ מקום לכסות מיקרו זכוכית על גבי ושימוש ברקמות הפנים בעדינות העיתונות זכוכית לכסות מיקרו על התאים. חותם עם לק.
10. ניתוח דגימות במיקרוסקופ confocal. השתמשנו LSM Microsystem 510, Carl Zeiss MicroImaging, Inc אשר היה מצויד עדשה 63X טבילה במים.
11. להכנת דמויות, להתאים ולשלב תמונות באמצעות תוכניות כגון Adobe Photoshop ו - Adobe Illustrator.

5. נציג תוצאות

לדוגמאות על אופן שיתוף ביטוי GTPases קטן מפריע VSVG מיון חביב מתייחסים מאמרים שפורסמו עבור missorting או apical ^{3, 4} או עיכוב משלוח פני ^7.

באיור 1. בשנת הזרקת מעושה, כלומר זריקה של קידוד רק פלסמיד VSVGts045-GFP, החלבון מועבר אל פני השטח basolateral היטב מקוטב תאים MDCK כמו להישפט על ידי צביעת השטח (באדום, איור 1). שים לב שלא כל VSVGts045-GFP מועברת הממברנה basolateral במהלך מרדף על 31 מעלות צלזיוס כפי שמעידים האות תאיים נרחב החלבון הכולל (בירוק, איורים 1 A ו-B). בתאים שאינם היטב מקוטב VSVGts045-GFP תימסר גם הממברנה apical (איור 1 ב '). אם דגימות השליטה שלך נראים כמו התא B באיור 1, אתה לא יכול לסמוך על הנתונים יש לחזור על הניסוי עם יותר מקוטב תאים. ברים הם סולם 5 מיקרומטר.

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר עבור ניסוי מוצלח microinjection הם איכות וטוהר של ה-DNA ואת הקוטביות של התאים שלך. ללא תאים מקוטב, שליטה זריקה שלך כבר mistargeted VSVG ואת הניסוי לא ניתן להשתמש. אם ה-DNA הוא באיכות ירודה, ה-DNA עשויה להדביק את מחט הזריקה המוביל עניים או כל ביטוי של החלבון הרצוי כלל. כמו כן, מומלץ להשתמש פלסמידים ביטוי ידועים להוביל רמות ביטוי גבוה כגון pRKV.

אם אתם רוצים לבדוק למיון של חלבונים מטען אחר, משמרת את הפרוטוקולים טמפרטורה יכול להיות שונה. לדוגמה, כדי להביע בצפיפות נמוכה קולטני ליפופרוטאין, אנו מבצעים את microinjection ב 37 ° C ואחריו הדגירה h 1 ב 37 ° C, 4 שעות בטמפרטורה של 20 ° C (כדי לעצור את המטען בתוך TGN) ו 2 ב 37 שעות מעלות צלזיוס בנוכחות cycloheximide מ"ג / מ"ל ​​0.1 לרדוף את החלבון אל פני השטח. במשך כמה חלבונים כגון קולטני FC, זמן הדגירה על 20 ° C עשוי להיות הוריד ל 2 שעות תלוי כמה מהר חלבון המטען שלך הוא מסונתז ונוסע דרך מסלול הפרשה. לקבלת תיאור מפורט של incubations שאנחנו משמשים החלבונים מטען שונה לראות נוקס et al. 2008 ^7.

לבסוף, פרוטוקול זה יכול לא רק לשמש לניתוח GTPases קטן, אך בתיאוריה לכל חלבונים או קטעי חלבונים שאתה חושד עשוי להיות פונקציה של משלוח (מקוטב) על פני השטח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400