Het analyseren van de functie van kleine GTPases door micro-injectie van Plasmids in de gepolariseerde epitheelcellen

Summary

Dit artikel beschrijft de procedures met betrekking tot overexpressie en analyse van kleine GTPases in gepolariseerd epitheliale cellen met behulp van micro-injectie techniek.

Abstract

Epitheliale cellen polariseren hun plasmamembraan in biochemisch en functioneel verschillende apicale en basolaterale domeinen waar de apicale domeinnaam wordt geconfronteerd met de 'vrije' oppervlakken en de basolaterale membraan is in contact met de ondergrond en de naburige cellen. Beide membraan domeinen zijn van elkaar gescheiden door tight junctions, die een diffusie barrière vormen. Apicale-basolaterale polarisatie met succes kunnen worden samengevat in de cultuur als epitheliale cellen zoals Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cellen worden gezaaid met een hoge dichtheid op polycarbonaat filters en gekweekt gedurende enkele dagen ^{een twee.} Opzetten en onderhouden van celpolariteit wordt geregeld door een reeks van kleine GTPases van de Ras superfamilie, zoals Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 en Rab13 ^{3 4 5 6 7.} Net als alle GTPases deze eiwitten cyclus tussen een inactieve GDP-gebonden toestand en een actieve GTP-gebonden toestand. Specifieke mutaties in de nucleotide binding regio's interfereren met deze fiets ^8. Bijvoorbeeld, is Rab13T22N permanent opgesloten in het BBP-vorm en dus noemde 'dominant negatief', terwijl Rab13Q67L niet meer kan hydrolyseren GTP en is dus opgesloten in een staat 'dominante actief' ^7. Voor het analyseren van hun functie in de cellen zowel dominant negatief en dominant actieve allelen van GTPases zijn meestal uitgedrukt in hoge mate te bemoeien met de functie van de endogene eiwitten ^9. Een elegante manier om een ​​hoog niveau van overexpressie in een korte tijd te bereiken is de invoering van de plasmiden die coderen voor de relevante eiwitten direct in de kernen van gepolariseerde cellen gekweekt op filter ondersteunt het gebruik van micro-injectie techniek. Dit wordt vaak gecombineerd met de co-injectie van de reporter-plasmiden die plasma membraan receptoren die specifiek zijn gesorteerd naar de apicale of basolaterale domeinnaam coderen. Een lading vaak gebruikt om lading te analyseren sorteren aan de basolaterale domein is een temperatuur gevoelig allel van de vesiculaire stomatitis virus glycoproteïne (VSVGts045) ^10. Dit eiwit kan niet goed voudig bij 39 ° C en zal dus worden bewaard in het endoplasmatisch reticulum (ER), terwijl de regulerende eiwit van belang is gemonteerd in de cytosol. Een verschuiving naar 31 ° C zal dan de mogelijkheid VSVGts045 goed te vouwen, laat de ER en reizen naar de plasmamembraan ^11. Dit jacht is meestal uitgevoerd in de aanwezigheid van cycloheximide om verdere eiwitsynthese die leidt tot schoner resultaten te voorkomen. Hier beschrijven we in detail de procedure van microinjecting plasmiden in gepolariseerde cellen en de daaropvolgende incubaties inclusief temperatuur verschuivingen die een uitvoerige analyse van regulerende eiwitten die betrokken zijn bij basolaterale sorteren mogelijk te maken.

Protocol

1. Isolatie van plasmide-DNA

1. Gebruik een Sigma-Aldrich endotoxine-vrij maxiprep kit om endotoxine vrij DNA voor te bereiden volgens de protocol van de fabrikant. Deze kit werkt voor ons, omdat het een betrouwbare manier verwijdert alle endotoxinen uit DNA-preparaten. Endotoxinen die met het DNA geïnjecteerd in celkernen zal leiden tot celdood.
2. Voeg 100 ul fenol / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1) om het geïsoleerde DNA, vortex en spin voor een min bij 13000 rpm in een Eppendorf microcentrifuge. Breng de bovenste water-fase in een nieuwe buis en voeg 100 ul chloroform / isoamylalcohol (24:1), vortex en spin zoals hierboven. Breng de bovenste water-fase waarin de DNA naar een nieuwe buis. Deze stap is nodig om elk eiwit uit het DNA, die voorkomt verstopping van de micro-injectie naald.
3. Neerslag van het DNA door het toevoegen van Na Acetaat (pH 6,0) tot een uiteindelijke concentratie van 300 mm en 2 X vol 100% ethanol. Incubeer bij -20 ° C gedurende de nacht. Spin DNA voor 20 min bij 13000 rpm in een Eppendorf microcentrifuge, een keer wassen met 70% ethanol, en resuspendeer in 300 ul endotoxine-vrij water (Sigma-Aldrich).
4. Bepaal DNA-concentratie. Een typische DNA-concentratie varieert van 1 tot 5 ug / ul.

2. Cultuur van MDCK cellen

1. Split MDCK cellen. Tellen cellen en zaad 4 X 10 ⁵ cellen op heldere 12-mm Transwell filters (0,4 micrometer poriegrootte, Corning Costar, 3460). Voor een experiment met een mock-injectie-controle en twee verschillende mutante Rab eiwitten je nodig hebt om zaad drie filters.
2. Cultuur MDCK cellen in MEM medium met 2 mM L-glutamine, 0,1 mg / ml penicilline / streptomycine en 7% (vol / vol) foetaal runderserum (= MEM groei media) bij 37 ° C en 5% CO _2.
3. Verandering media in de basolaterale kamer elke dag. Dit helpt de polarisatie proces, omdat het bootst de situatie van de epitheelcellen in dieren.
4. 2 dagen na zaaien check-in een microscoop of de cellen groeien in een gesloten monolaag. Als u geen gaten te detecteren in de monolaag, voert u uw experiment op dag 3. Als er nog steeds gaten, voert u uw experiment op dag 4.

3. Micro-injectie Procedure en post-injectie Incubaties

1. Op de dag van het experiment voor te bereiden 5 ml MEM groei media plus 50 mM HEPES in een 60 x 15 mm plaat voor elk filter en plaats in een 39 ° C incubator. Daarnaast, stelt u een well van een 12-wells plaat met 1 ml MEM groei media plus 50 mM HEPES en 0,1 mg / ml cycloheximide per filter en plaats in een 31 ° C incubator.
2. Zet uw micro-injectie microscoop en stel de verwarmde etappe naar 39 ° C. We maken gebruik van een omgekeerde microscoop (Axiovert 200, Carl Zeiss microimaging, Inc) met een verwarmd podium, 10X en 32X doelstellingen en een Eppendorf Femtojet (Injectman NI2). Ten slotte opent de stikstof gas tank die de lucht tafel levert met stikstof.
3. Verdunnen DNA met gefilterd water (gebruik 0,2 um filter) tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg / ml in een totaal volume van 10 - 100 pl. Vervolgens, spin-DNA in Eppendorf microcentrifuge bij 13.000 rpm gedurende 30 minuten. Verwijder de bovenste gedeelte en plaats in een nieuwe buis. Deze stap zorgt ervoor dat wanneer u uw verdund DNA te laden in de micro-injectie naald u nauwkeurig kunt laden "schoon" DNA. Je DNA is nu klaar voor micro-injectie.
4. Bereid uw cellen door het nemen van de eerste filter uit de cultuur schotel. Met een chirurgisch mes (Feather chirurgische Blade, roestvrij staal, nr. 11), knip de filter uit de filterhouder en plaats in 5 ml, 39 ° C warm MEM groei media plus 50 mM HEPES (60 x 15 mm plaat). Verzwaren van de filter in de cultuur plaat met de chirurgische mes die u gebruikt voor het knippen het uit. Plaats het op de filter zodanig dat het gat van de chirurgische mes het midden van het filter omringt. Plaats uw cultuur bord op de verwarmde tafel van de microscoop.
5. Belasting 2-3 ul van uw verdund DNA (in dit geval plasmiden die coderen voor VSVGts045-GFP = mock injectie controle) in een micro-injectie naald (Femtotip II, Eppendorf, 930000043), draai de beschermkap van de naald en laat hem op de vloer vallen . Nu is de naald is klaar om te worden geschroefd in de houder. Om dit te doen, drukt u op de menutoets van je injectman en zorg ervoor dat de klep is uitgeschakeld. Schroef de naald in de houder, pas op niet te schroeven in de naald te strak als dat kan leiden tot breuk. Nu, de menu-toets te drukken, zal de toegepaste P _c voorkomen dat de media uit worden gezogen in de naald tijdens de microinjeciton procedure. Tot slot, tikt u op uw joystick om de opgeslagen homing te wissen.
6. Het verlagen van de naald op de cellen, gebruik maken van de 10X objectief en breng de naald in de lichtbundel boven de vloeistof. Nu richten op de cellen, opnieuw de aandacht te brengen door te draaien aan de focus wiel 180 ° omhoog, en vind de naald. Vervolgens langzaam de naald te verplaatsen in beeld, dan brengen van de focus weer (te werken tot het brengen van de cellen in beeld weer) komen, de naald in de voorcus opnieuw. Herhaal dit totdat de naald raakt het oppervlak van de media, op welk punt alles wat je ziet is een halo. Als je een punt waarop de cellen in focus te bereiken, maar de naald is nog steeds vaag (dat wil zeggen uit de focal plane) verandering in het 32X objectief en fijn grof instellingen.
7. Stel de z-te beperken door het aanraken van de apicale membraan met de punt van de naald en aftrekken van ongeveer 10 micrometer als de kernen waarin ongeveer 10 urn onder het apicale membraan.
8. Nadat u de z-limiet, vinden van de juiste inspuitdruk. Begin bij 95 PSI. Als de druk te hoog is, zullen je cellen opblazen. Als je de druk te laag is, ziet u een witte stip die blijft, maar verder niets gebeurt. Met een succesvolle injectie, ziet u een fase veranderen zonder een cel grootte aan te passen. Voor de injectie, breng de naald een paar micron uit de focal plane zo snel mogelijk. Richt met de naald boven de kern (dat wil zeggen het midden van een individuele cel) en druk op de injectie-knop van uw joystick, maar niet houd de knop ingedrukt.
9. Injecteer 100-500 cellen in het gat van de chirurgische mes dat ligt aan je cellen. Als u klaar bent, plaats je cellen met de cultuur schotel en chirurgische mes in een 39 ° C incubator, en incubeer gedurende 2 uur Gedurende deze tijd, is VSVGts045-GFP tot expressie gebracht en uitgescheiden in het ER. Echter, bij 39 ° C, kan VSVGts045-GFP niet correct vouwen en kan dus niet verlaten van de ER. Ondertussen zal de kleine GTPase van belang zich ophopen in het cytosol in co-injectie experimenten.
10. Na 2 uur, plaats uw cellen in 1 ml MEM groei media plus 50 mM HEPES en 0,1 mg / ml cycloheximide in een 12-well plaat en incubeer gedurende 2 uur bij 31 ° C. Tijdens deze achtervolging periode zal VSVGts045-GFP correct vouwen, laat de ER en wordt geleverd aan het celoppervlak.
11. Herhaal de stappen 3,1 tot 3,10 voor de filters twee (injecteren plasmiden die coderen voor VSVGts045-GFP en bijvoorbeeld V5-gelabeld Rab13T22N) en drie (injecteren plasmiden die coderen voor VSVGts045-GFP en bijvoorbeeld V5-gelabeld Rab13Q67L). Elke injectie duurt ongeveer 20 - 60 minuten. Het is echter absoluut van cruciaal belang om elk filter op dezelfde manier te behandelen door de temperatuur verschuiving incubaties en het oppervlak vlekken totdat je het hersteld de cellen. Na fixatie, mag u de rest van uw kleuringsprotocol voor alle filters tegelijk.

4. Oppervlak Kleuring voor immunofluorescentie analyse

Let op, om te voorkomen bleken van de GFP signaal van VSVGts045-GFP, de bescherming van de exemplaren van het licht door het bedekken met aluminium folie tijdens alle volgende procedures.

1. Wilt u het oppervlak vlekken uit te voeren, plaats je cellen in een cultuur schotel op een metalen plaat op het ijs en was uw cellen 1x met ijskoude PBS ^{2 +} (PBS [0,2 g / liter KCl, 0,2 g / liter KH ₂ PO _4, 8 g / liter NaCl, en 2,17 g / liter Na ₂ HPO ₄ x 7 H ₂ O], plus 0,1 g / liter CaCl ₂ en 0,1 g / liter MgCl ₂ x 6 H ₂ O). Vervolgens, plaats 30 pi van een antilichaam dat het ectodomein van uw proteïne herkent, in dit geval de muis monoklonaal antilichaam TK1 (IgG _1, verkregen uit de late Thomas Kreis), op een schone parafilm geplaatst op de metalen plaat op het ijs. Plaats het filter met uw cellen ondersteboven op de daling en voeg een paar druppels van het antilichaam op de achterzijde van het filter. Incubeer gedurende 1 uur op ijs.
2. Plaats cellen in een 12-wells plaat, was 3x met ijskoude PBS ^{2 +} (of RT warm PBS ^{2 +} zonder voorafgaande oppervlak vlekken), en bevestig met 3% paraformaldehyde gedurende 15 min bij RT.
3. Een keer wassen cellen met PBS ^{2 +} en laat in PBS ^{2 +} gedurende 5 minuten.
4. Incubeer de cellen in het blokkeren / permeabilisatie buffer (BPB) (2% [wt / vol] BSA, 0,4% [wt / vol] saponine in PBS ^{2 +)} met 10% [vol / vol] geit serum. Incubeer 1 uur bij RT.
5. Verdunnen primaire antilichamen tegen de uitdrukkelijke Rab GTPase te ontdekken, in dit voorbeeld anti-V5 (muis monoklonaal antilichaam IgG _2a, Invitrogen), 1:200 in het BPB. Spin verdund antilichamen in een Eppendorf microcentrifuge gedurende 10 minuten bij 13.000 rpm. Plaats 30 ul van het antilichaam-oplossing op schone parafilm geplaatst in een vochtige kamer. Plaats de cellen op filter op zijn kop op het antilichaam te laten vallen en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
6. Plaats cellen terug (rechts boven) in een 12-wells plaat en was 5x meer dan 30 min met BPB bij RT.
7. Verdunnen passende secundaire antilichamen, in dit geval geit anti-muis IgG _een Alexa 594-gelabeld (voor VSVG detectie aan de oppervlakte, Invitrogen), en Cy5-gelabelde secundaire antilichamen aan uw Rab GTPase, in dit voorbeeld geit herkennen anti-muis IgG _2a Cy5-gelabelde (Jackson ImmunoResearch), 1:200 tot BPB en spin zoals hierboven. Plaats 30 ul antilichaamoplossing op een schone parafilm in een natte kamer en plaats cellen op filter op zijn kop op het antilichaam te laten vallen. Incubeer 1 uur bij RT.
8. Herhaal stap 4.6.
9. Dip cellen op filter 3X in gedeïoniseerd water en plaats right kant naar boven op microslides. Voeg 10-15 ul mount (10% [wt / vol] DABCO, 50% [wt / vol] glycerol in gedestilleerd water) op de top van de cellen. Plaats 18x18 mm micro dekglas op de top en het gebruik van gezichtstissues voorzichtig op de micro-dekking van glas op de cellen. Seal met nagellak.
10. Analyseer exemplaren met een confocale microscoop. We gebruikten een Microsystem LSM 510, Carl Zeiss microimaging, Inc, dat werd uitgerust met een 63x onderdompeling in water lens.
11. Voor de voorbereiding van de cijfers aan te passen en te combineren afbeeldingen met behulp van programma's zoals Adobe Photoshop en Adobe Illustrator.

5. Representatieve resultaten

Voor voorbeelden over hoe de co-expressie van kleine GTPases interfereert met VSVG sorteren vriendelijk verwijzen naar gepubliceerde artikelen voor zowel apicale missorting ^{3, 4} of remming van het oppervlak aflevering ^7.

Figuur 1. In de mock-injectie, een injectie van alleen de plasmide coderend VSVGts045-GFP dat wil zeggen, is het eiwit geleverd aan de basolaterale oppervlak van goed-gepolariseerde MDCK cellen zoals beoordeeld door oppervlakte-kleuring (in het rood, figuur 1 A). Merk op dat niet alle van de VSVGts045-GFP wordt geleverd aan de basolaterale membraan tijdens het achtervolgen bij 31 ° C, zoals blijkt uit de uitgebreide intracellulaire signaal voor de totale hoeveelheid eiwit (in het groen, figuren 1 A en B). In cellen die niet goed zijn gepolariseerd VSVGts045-GFP zal ook worden geleverd aan de apicale membraan (figuur 1 B). Als je controle monsters lijken de cel in Figuur 1 B, kun je niet vertrouwen uw gegevens en moeten het experiment met betere-gepolariseerde cellen te herhalen. Schaal bars zijn 5 micrometer.

Discussion

De belangrijkste stappen voor een succesvolle micro-injectie experiment zijn de kwaliteit en de zuiverheid van het DNA en de polariteit van je cellen. Zonder gepolariseerde cellen, zal de injectie controle al mistargeted VSVG en het experiment kan niet worden gebruikt. Als het DNA is van slechte kwaliteit, kan het DNA verstoppen de injectienaald die leidt tot slechte of geen expressie van het gewenste eiwit helemaal. Ook is het raadzaam om expressieplasmiden waarvan bekend is dat leiden tot hoge expressie niveaus, zoals pRKV gebruik.

Als u wenst om te testen voor het sorteren van andere lading eiwitten, kan de temperatuur verschuiving protocollen worden aangepast. Bijvoorbeeld, om low-density lipoprotein receptoren tot expressie brengen, voeren we de micro-injectie bij 37 ° C, gevolgd door een 1 uur incubatie bij 37 ° C, 4 uur bij 20 ° C (aan de lading in de TGN arrestatie) en 2 uur bij 37 ° C in de aanwezigheid van 0,1 mg / ml cycloheximide aan het eiwit jacht naar de oppervlakte. Voor sommige eiwitten zoals Fc-receptoren, de incubatietijd bij 20 ° C kan worden verlaagd tot 2 uur afhankelijk van hoe snel uw lading eiwit wordt gesynthetiseerd en reist door de secretieroute. Voor een gedetailleerde beschrijving van incubaties die we hebben gebruikt voor verschillende lading eiwitten zien Nokes et al.., 2008 ^7.

Tot slot kan dit protocol niet alleen worden gebruikt voor de analyse van de kleine GTPases, maar in theorie voor alle eiwitten of eiwitfragmenten die u vermoedt dat een functie in (gepolariseerde) oppervlak levering te hebben.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axiovert 200 Microscope with heated stage	Carl Zeiss, Inc.	Custom order
Injectman NI2 Femtojet micromanipulator	Eppendorf	Custom order
Femtotips II (Microinjection needles)	Eppendorf	930000043
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Clear 12-mm transwell filter supports	Corning	3460
Endotoxin-free plasmid maxiprep kit	Sigma-Aldrich	NA0400