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Neuroscience

मानचित्रण और बढ़ाने जाल Flippase अभिव्यक्ति की लारवल और वयस्क में आवेदन ड्रोसोफिला सीएनएस

Published: June 3, 2011 doi: 10.3791/2649
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Zoology, University of Oklahoma - Norman, 2Department of Biology, Brandeis University

Summary

हम एक Flippase प्रेरित intersectional Gal80/Gal4 दमन विधि (FINGR) का वर्णन है, ऊतक विशेष FLP Gal80 अभिव्यक्ति पैटर्न को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. Gal4 और FLP ओवरलैप, जहाँ भी Gal4 अभिव्यक्ति चालू है (Gal80 बाहर रूप से फ़्लिप) या बंद (Gal80 में रूप से फ़्लिप). FINGR विधि clonal विश्लेषण और तंत्रिका सर्किट मानचित्रण के लिए बहुमुखी है.

Abstract

द्विआधारी / Gal4 यूएएस विधि जीन और ड्रोसोफिला में तंत्रिका circuitry हेरफेर के लिए शक्तिशाली है . सबसे neurobiological पढ़ाई के लिए, तथापि, Gal4 अभिव्यक्ति शायद ही पर्याप्त है ऊतक विशेष व्यवहार readouts के साथ सर्किट के सटीक सहसंबंध के लिए अनुमति. इस बड़ी बाधा को दूर करने के लिए, हम हाल ही में FINGR विधि विकसित करने के लिए ब्याज के ऊतकों में अधिक प्रतिबंधात्मक Gal4 अभिव्यक्ति को प्राप्त करने. 1) पारंपरिक Gal4/UAS प्रणाली;) 2 / FLP FRT की मध्यस्थता Gal80 परिवर्तित उपकरणों का एक सेट है, और 3) बढ़ाने के जाल FLP (ईटी FLP): FINGR विधि तीन घटक होते हैं. Gal4 ब्याज की प्राथमिक तंत्रिका circuitry को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. साथ Gal4 नीचे आएगी यूएएस - effector यूएएस MJD78Q या टीएस यूएएस - शि के रूप में है, neuronal गतिविधि है, जो बारी में मक्खी के व्यवहार में परिवर्तन के द्वारा प्रकट है को नियंत्रित करता है. यूएएस GFP, विशिष्ट व्यवहार में शामिल तंत्रिका सर्किट के रूप में एक अतिरिक्त के साथ यूएएस के रिपोर्टर एक साथ morphological विश्लेषण के लिए मैप किया जा सकता है. टब पी>> Gal80 ('बाहर फ्लिप') और टब P>> Gal80 ('फ्लिप') बंद करो: व्यापक अभिव्यक्ति के साथ Gal4 लाइनों के लिए, Gal4 अभिव्यक्ति दो पूरक Gal80 परिवर्तित उपकरण का उपयोग करके प्रतिबंधित किया जा सकता है अंत में, जांचकर्ताओं Gal80 मोड़ पर या बंद कर सकते हैं, क्रमशः ऊतक विशेष एट - FLP की मदद के साथ,. फ्लिप मोड में, Gal80 Gal4 अभिव्यक्ति है जहाँ भी एक दूसरे को काटना Gal4 और ईटी - FLP दबाने जाएगा. फ्लिप बाहर मोड में, Gal80 जिसमें Gal4 और FLP ओवरलैप कोशिकाओं में Gal4 दमन से राहत मिल जाएगी. दोनों दृष्टिकोण Gal4 परिभाषित circuitry में कोशिकाओं की संख्या का प्रतिबंध सक्षम है, लेकिन एक व्युत्क्रम पैटर्न में. FINGR विधि मक्खी समुदाय में Gal4 लाइनों और पारंपरिक clonal विश्लेषण के लिए और तंत्रिका सर्किट मानचित्रण के लिए अत्यधिक बहुमुखी के विशाल संग्रह के साथ संगत है. इस प्रोटोकॉल में, हम का चयन करें एट FLPx2 लाइनों और फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में FINGR विधि की प्रभावशीलता में FLP अभिव्यक्ति पैटर्न के मानचित्रण प्रदर्शित करता है. FINGR विधि का सिद्धांत भी अन्य आनुवंशिक मॉडल जीवों में जो का Gal4/UAS, Gal80, और / FLP FRT उपयोग किया जाता है है लागू किया जाना चाहिए.

Protocol

1. ड्रोसोफिला उपभेदों

  1. Gal4 ड्राइवर:
    जीएमआर - Gal4, जो फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में Gal4 व्यक्त.
  2. यूएएस लाइनों
    (यूएएस या polyQ) UAS MJD78Q, जो Gal4 व्यक्त कोशिकाओं में तंत्रिका अध: पतन का कारण बनता है.
    यूएएस GFP, जो Gal4 व्यक्त कोशिकाओं में GFP व्यक्त.
  3. FLP लाइनों
    ey-FLP, जो photoreceptors और मस्तिष्क क्षेत्रों के सबसेट में FLP व्यक्त.
    एट FLPx2 लाइनों, जो बढ़ाने जाल लाइनों FLP की दो प्रतियां (FLP IRES - FLP) से युक्त हैं. हम ~ +१००० एट FLP (Bohm एट अल., 2010) लाइनों, जिनकी अभिव्यक्ति पैटर्न अभी तक कर रहे हैं लक्षण वर्णन किया जा उत्पन्न किया है. यहाँ, हम का चयन करें एट - FLPx2 के लार्वा और वयस्क मक्खी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) में अभिव्यक्ति पैटर्न के लक्षण वर्णन का वर्णन.
  4. FLP रिपोर्टर
    YW, actin पी>> Gal4 CD2, यूएएस GFP (Pignoni और Zipursky, 1997), जिसके माध्यम से एट - FLPx2 की अभिव्यक्ति पैटर्न की रिपोर्ट actin पी> Gal4, FLP की मध्यस्थता> CD2 के recombinational छांटना पर यूएएस GFP .
  5. दो पूरक Gal80 परिवर्तित उपकरण
    टब पी>> Gal80 (गॉर्डन स्कॉट, 2009), फ्लिप - बाहर का निर्माण, जो constitutively एक मजबूत ट्यूबिलिन प्रमोटर द्वारा संचालित सभी ऊतकों में Gal80 व्यक्त. FLP-मध्यस्थता पुनर्संयोजन पर, Gal80> बाहर रूप से फ़्लिप किया है और Gal80 अभिव्यक्ति में ही समाप्त होता है - एट - FLPx2 व्यक्त ऊतकों.
    टब पी>> (Bohm एट अल., 2010) Gal80, बंद करो निर्माण, जो Gal80 सामान्य परिस्थितियों में व्यक्त नहीं करता है फ्लिप. Gal80 अभिव्यक्ति पर ट्यूबिलिन में ही प्रमोटर द्वारा चालू है एट FLPx2 व्यक्त ऊतकों में जो FLP> रोक flips और Gal80 में flips.
  6. चक्रवृद्धि आंख में FLP गतिविधि का परीक्षण करने के लिए मक्खियों
    जीएमआर Gal4, यूएएस polyQ; टब पी> Gal80> (Bohm एट अल, 2010), और जो पतित depigmented आँखें बंद करो. में FLP व्यक्त फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं, polyQ अभिव्यक्ति Gal80 फ्लिप - में निम्नलिखित चालू है.
    जीएमआर Gal4, यूएएस - polyQ (Bohm एट अल, 2010) टब पी Gal80>> है, जो सामान्य आँखों है . में FLP फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं व्यक्त, polyQ अभिव्यक्ति Gal80 निम्नलिखित फ्लिप बाहर कर दिया है.

2. अभिकर्मकों

फास्फेट बफर खारा (Pbs, 1X), 7.4 पीएच.
4% (पीएफए) paraformaldehyde, 16% से पीएफए, EM ग्रेड (15,710 # बिल्ली, इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी विज्ञान, Hatfield, PA) पीबीएस में पतला
पीबीटी, 0.1% Triton एक्स 100 (सिग्मा) युक्त 1XPBS
विरोधी Elav (MAB, 9F8A9, विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, आयोवा विश्वविद्यालय), ड्रोसोफिला में सभी न्यूरॉन्स दाग.
एंटी रेपो (MAB 8D12, विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, आयोवा विश्वविद्यालय) ड्रोसोफिला में glial कोशिकाओं दाग.
एलेक्सा माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ 594 चिकन (Invitrogen)

3. बढ़ाने के जाल FLPx2 लाइनों की अभिव्यक्ति पैटर्न (* महत्वपूर्ण कदम) मानचित्रण

  1. YW से कुंवारी महिलाओं ले लीजिए, actin पी>> Gal4 CD2; लाइन यूएएस GFP और व्यक्तिगत एट FLPx2 लाइनों के पुरुषों के लिए पार . पूर्व एट FLP के ऊतक अभिव्यक्ति के लिए GFP पत्रकार के रूप में कार्य करता है.
  2. * 3 Rd instar F1 लार्वा भटक काटना, CNS (यानी, मस्तिष्क और उदर तंत्रिका कॉर्ड में, VNC) और शरीर की दीवार को बनाए रखने, 4% पीएफए ​​में 1 घंटे के लिए बर्फ पर तय, पीबीएस ठंडा के साथ 3X धोने के द्वारा पीछा किया पीबीटी साथ 3X washes.
    विच्छेदन
    1. 3 Rd instar F1 लार्वा भटक निकालें और उन्हें एक साफ Sylgard पकवान (35 मिमी x 10 मिमी पेट्री Sylgard की 2 ग्राम से भरा पकवान मिश्रित के निर्देशों निर्माण के अनुसार) में जगह.
      1. तूलिका के साथ खाना मलबे निकालें
    2. लार्वा anesthetize ठंडा बर्फ पर 1XPBS और जगह के साथ पकवान भरें
    3. संदंश की एक जोड़ी के साथ एक लार्वा के मुंह के हुक को पकड़ो और संदंश की एक और जोड़ी के साथ पूर्वकाल झरोखा विस्तार के पास और पीछे के अंत की ओर छल्ली छील छल्ली ले लो. सीएनएस के मुंह से जुड़ी होगी लार ग्रंथियों, आंत, और imaginal डिस्क के साथ हुक.
    4. अतिरिक्त ऊतक और imaginal सीएनएस आसपास डिस्क निकालें.
    5. पीबीएस से भरे तीन अच्छी तरह से pyrex पकवान में सीएनएस स्थानांतरण.
      1. एक siliconized P200 विंदुक टिप ऊतक सुखाने से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    6. बर्फ पर 200 4% पीएफए ​​के μl में 1 घंटे के लिए ठीक है.
      1. सुनिश्चित करें कि सीएनएस पूरी तरह पीएफए ​​में डूबे हुए है.
        1. यदि सीएनएस तैरता है, यह आम तौर पर पता चलता है कि सीएनएस ठीक से आसपास के ऊतकों से साफ नहीं है.
    7. पीबीएस ठंडा के साथ 3X पीबीटी साथ 3X washes द्वारा बाद धो लें.
  3. * वयस्क F1 मक्खियों के सीएनएस काटना.
    1. सीओ 2 के साथ मक्खियों anesthetize या बर्फ पर 10 मिनट के लिए एक खाली शीशी के अंदर निहित मक्खियों जगह.
    2. प्लेस वयस्क एक 95% EtOH से भरे बर्फ पर 30 सेकंड के लिए गिलास पकवान में मक्खियों.
    3. बर्फ पर एक गिलास पकवान भरा 1XPBS में वयस्क मक्खियों स्थानांतरण.
      1. ठंडा 1X पीबीएस के साथ 3X धो करने के लिए अवशिष्ट EtOH हटायें
    4. एक 35 मिमी Sylga में एक मक्खी प्लेसतीसरी पकवान ठंडा 1X पीबीएस से भरा
    5. उदर की ओर का सामना करना पड़ रहा प्लेस और एक छोटे कीट कलम सम्मिलित (minutiens पिन 0.1 मिमी) पेट के माध्यम से रास्ते के मध्य में है.
      1. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग पैर के आधार पकड़ और संदंश की एक और जोड़ी के साथ पैर को हटाने.
    6. सिर छल्ली निकालें
      1. हालांकि संदंश की एक जोड़ी के साथ सूंड हथियाने, आँख के नीचे और उड़ सिर के पृष्ठीय मध्य रेखा की ओर छल्ली छील एक अन्य जगह.
      2. दूसरी आँख पकड़ो और दूसरी तरफ शेष छल्ली हटा दें.
      3. तेज संदंश और / या तीव्रता टंगस्टन सुई का प्रयोग, tracheal मस्तिष्क आसपास के ऊतकों को हटा दें
        1. मजबूत ऑटो प्रतिदीप्ति में ट्रेकिआ के अनुचित सफाई परिणाम GFP अभिव्यक्ति में बाधा डालने, और मस्तिष्क फिक्सिंग के दौरान फ्लोट करने की अनुमति
    7. VNC विच्छेदन
      1. वक्ष छल्ली निकालें
        1. छाती के पीछे अंत में शुरू, 3 Rd preepisternum के प्रत्येक पक्ष पर दो संदंश (यानी, पिछले पैरों के आधार हथियाने).
        2. धीरे छल्ली वेंट्रल midline लाइन से दूर अलग, यह दोहराना जब तक आप गर्दन के आधार तक पहुँचने.
        3. धीरे वक्ष छल्ली के दो halves VNC उजागर फैल
      2. अगले छाती से पेट को हटा दें. हालांकि संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए दूसरे चरण के आधार पर छाती पकड़, संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करने के लिए हड़पने 1 पेट sternite के पास पेट और पेट हटा.
      3. VNC के आसपास के वक्ष ऊतकों से हटायें. संदंश की एक जोड़ी के साथ और संदंश कोमल दूर आंसू वक्ष लोथ के बहुमत की एक और जोड़ी के साथ कंधे का क्षेत्र पकड़ो.
      4. इस बिंदु पर वहाँ संयोजी गर्भाशय ग्रीवा (गर्दन) संयोजी आसपास के ऊतकों की एक अंगूठी किया जाना चाहिए. दो संदंश का प्रयोग अंगूठी फाड़.
      5. किसी भी अतिरिक्त वक्ष VNC के आसपास के ऊतकों को निकालें
    8. 9 अच्छी तरह Pyrex पकवान बर्फ पर 1X पीबीएस युक्त मस्तिष्क और VNC के स्थानांतरण
      1. एक siliconized P200 विंदुक टिप ऊतक सुखाने से बचने के इस्तेमाल किया जा सकता है
  4. * बर्फ पर 4% पीएफए ​​में 1 घंटे के लिए वयस्क सीएनएस और ठीक ठंडा पीबीएस और पीबीटी साथ 3X के साथ 3X धोने.
  5. 4 में वयस्क सीएनएस तैयारी या लार्वा सीएनएस और शरीर दीवार सेते डिग्री सेल्सियस या तो (विरोधी Elav, 01:10) न्यूरॉन्स या glia (01:10 anti-Repo.) करने के लिए एंटीबॉडी के साथ रात भर. पीबीटी साथ 5X तैयारी धो लें.
  6. एलेक्सा 2 बजे के लिए कमरे के तापमान पर 594 माउस माध्यमिक एंटीबॉडी (1:100) के खिलाफ चिकन के साथ वयस्क या लार्वा तैयारी के साथ सेते हैं, और पीबीएस के साथ तैयारी धोने.
  7. किसी स्लाइड पर लार्वा या वयस्क सीएनएस माउंट. सीएनएस की प्राकृतिक आकार की रक्षा के लिए, एक मिनी पुल के रूप में स्लाइड पर एक ओ के आकार का प्लास्टिक की अंगूठी (साफ सुदृढीकरण लेबल, Avery Dennison, कार्यालय उत्पाद, Brea, सीए) का उपयोग करने के लिए कवर पर्ची निलंबित.
  8. GFP और Elav (रेपो या) एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के तहत अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए तैयार की जांच करना.

4. Gal4 दमन में दो पूरक Gal80 परिवर्तित उपकरणों की photoreceptors में आवेदन

  1. Gal80 Flipping टब के माध्यम से बाहर पी Gal80>> (चित्रा 5A).
    1. टब पी Gal80>> लाइन, जीएमआर Gal4, यूएएस - polyQ से पुरुषों ले लीजिए . ध्यान दें कि यौगिक आँखें इन मक्खियों में सामान्य हैं.
    2. Ey-FLP कुंवारी साथ मेट.
    3. F1 मक्खियों लीजिए और आंख phenotype की जांच.
  2. के माध्यम से टब में Gal80 Flipping पी> Gal80> (चित्रा 5B) बंद करो.
    1. जीएमआर Gal4, यूएएस - polyQ लीजिए, टब पी>> Gal80 पुरुष मक्खियों बंद करो और आंख phenotype की जांच. नोट पतित और इन मक्खियों depigmented आँखों जंगली प्रकार उपभेदों (केण्टन एस) की तुलना
    2. Ey-FLP कुंवारी के साथ मेट;
    3. F1 मक्खियों लीजिए और आंख phenotype की जांच.
  3. चुनें - एट फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के साथ FLPx2 लाइनों

चरण 4.1 और 4.2 एट - FLPx2 लाइनों का उपयोग कर दोहराया जा सकता है है कि फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की एक सबसेट में व्यक्त FLP. वैकल्पिक रूप से, या तो जीएमआर - Gal4, यूएएस polyQ; टब पी> रोक> Gal80 मक्खियों या जीएमआर - Gal4, यूएएस polyQ; टब पी Gal80> मक्खियों स्क्रीन व्यक्तिगत एट FLPx2 लाइनों लाइनों के लिए पार किया जा सकता है> कि एक्सप्रेस फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में FLP. मूल्यवान एट FLPx2 - लाइनों उन रहे हैं कि केवल एक सबसेट या एकल फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (चित्रा 6) में व्यक्त FLP.

5. प्रतिनिधि परिणाम

एक विशिष्ट लाइन एट FLPx2 की अभिव्यक्ति पैटर्न आसानी से हो सकता है और जांच कर सकते हैं F1 लार्वा या वयस्क मक्खियों YW, actin पी के बीच पार से व्युत्पन्न में प्रलेखित>> Gal4 CD2, यूएएस - GFP कुंवारी और एट - FLPx2 पुरुषों (चित्रा 1) . आमतौर पर, तीन से पांच F1 जानवरों की replicates dissected और FLP अभिव्यक्ति पैटर्न (Bohm एट अल., 2010) के reproducibility का निर्धारण करने के लिए जांच. (चित्रा 3 & 4) का उपयोग विश्लेषण कर सकते हैं .

7 चित्र में दिखाया गया है परिणामों की प्रभावशीलता Gal80 फ्लिप - में वर्णन और Gal4 निम्नलिखित FLP की मध्यस्थता पुनर्संयोजन के intersectional दमन प्रणालियों में बाहर फ्लिप. टब पी> रोक> Gal80 निर्माण करने के लिए Gal80 के किसी भी टपकाया अभिव्यक्ति (वर्दी और photoreceptors के अध: पतन depigmentation पर आधारित) प्रकट नहीं करता, और अभी तक यह 100% Gal80 eyFLP की मदद के साथ दबाने से flipping में प्रभावी है जीएमआर Gal4 और सामान्य दिखावे (छवि 7A) के लिए आंख बहाल . इसके विपरीत, टब पी Gal80>> पूरी तरह से जीएमआर Gal4 eyFLP की शुरूआत से पहले represses. Gal80 के बाद फ्लिप बाहर, जीएमआर Gal4 ड्राइव अभिव्यक्ति यूएएस polyQ पतित और depigmented आँखों (छवि 7B) प्रमुख,. इस उदाहरण में, हम एक अखिल photorecetor FLP इस्तेमाल किया लेकिन फोटोरिसेप्टर 'सर्किट' नक्शा व्यवहार परिणामों की जांच नहीं. Behaviorally प्रासंगिक Gal4 लाइनों के साथ इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम CCAP Gal4 सर्किट का हिस्सा मैप वयस्क मक्खियों में दक्षिणपंथी विस्तार (Bohm एट अल., 2010) को विनियमित. हम मानते हैं कि FINGR विधि व्यवहार के neuronal आधार की हमारी समझ को सहायता में मूल्यवान होगा.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक एट FLPx2 लाइन की अभिव्यक्ति पैटर्न एक लाइन एट FLPx2 से FLP अभिव्यक्ति पैटर्न (नीला ovals) की जांच एक एट FLPx2 पुरुष (ऊपर छोड़ दिया) के साथ एक actin पी> CD2> Gal4 पार करके निर्धारित किया जा सकता है ; यूएएस GFP कुंवारी (शीर्ष सही). सर्वव्यापी actin> माता - पिता की महिला में Gal4 अभिव्यक्ति पी FRT (ग्रे त्रिकोण) flanked CD2 अनुक्रम की प्रविष्टि द्वारा बाधा है. F1 संतान में, FLP CD2 अनुक्रम आबकारी, actin पी Gal4> यूएएस - GFP अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए अनुमति होगी.

चित्रा 2
चित्रा 2. लार्वा और वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एक लाइन एट FLPx2 की अभिव्यक्ति पैटर्न. इन छवियों चित्रित CNS (मस्तिष्क और उदर तंत्रिका कॉर्ड, VNC) संभोग YW, actin पी से उत्पादित वंश से dissected>> Gal4 CD2, एट - FLPx2 173A लाइन के लिए माता पिता यूएएस GFP . > CD2> कैसेट recombining FLP actin पी अभिव्यक्ति GAL4> (यूएएस GFP के फलस्वरूप अभिव्यक्ति) सक्रिय. इसलिए, GFP पैटर्न FLP-व्यक्त कोशिकाओं की रिपोर्ट है. कक्ष एक लार्वा FLP अभिव्यक्ति पैटर्न से पता चलता है जबकि पैनल बी रेखा 173A में वयस्क अभिव्यक्ति पैटर्न से पता चलता है है.

चित्रा 3
चित्रा 3. सेल प्रकार जो एट FLPx2 रेखा 688A # में flippase व्यक्त की विशेषता एक तय F1 3 Rd instar लार्वा एट FLPx2 लाइन 688A # और एक GFP Flippase रिपोर्टिंग लाइन के बीच एक क्रॉस से विरोधी रेपो के साथ दाग के एक समग्र छवि . बी.डी., एक उच्च वृद्धि (Zeiss योजना Apochromat 63x तेल) 3 Rd instar लार्वा से एक VNC के पीछे के अंत से लिया देखने .

चित्रा 4
चित्रा 4. सेल प्रकार की विशेषता 150 # एट - FLPx2 रेखा के मशरूम शरीर के भीतर एसी, एक निश्चित F1 3 instar विरोधी रेपो के साथ दाग लार्वा से मशरूम शरीर के एक उच्च बढ़ाई छवि (63x तेल विसर्जन) .

चित्रा 5
चित्रा 5. Gal80 फ्लिप और फ्लिप बाहर रणनीतियाँ के चित्रण. फ्लिप बाहर रणनीति में ए, के प्रमोटर संचालित ट्यूबिलिन Gal80 (टब पी Gal80>>) constitutively सक्रिय है, जीएमआर Gal4 के दमन और एक आँख जंगली प्रकार phenotype (लाल आँख) में जिसके परिणामस्वरूप. यह दमन FLP (बैंगनी), जो बाहर Gal80 (मध्यम, लाल) फ्लिप और जीएमआर Gal4 यूएएस - polyQ अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए अनुमति देगा का परिचय द्वारा हटा दिया जाता है. फोटोरिसेप्टर सेल अध: पतन में यह परिणाम (आंखों में सफेद डॉट्स द्वारा सचित्र) बी. पिछले रणनीति का पारस्परिक में प्रमोटर संचालित ट्यूबिलिन Gal80 अभिव्यक्ति FRT (ग्रे त्रिकोण) "रोक" codon flanked द्वारा बाधित है. Gal80 के अभाव में, जीएमआर Gal4 यूएएस - polyQ बांध photoreceptors में neuronal अध: पतन (आंखों में सफेद डॉट्स द्वारा सचित्र) के कारण. जीएमआर Gal4, यूएएस - polyQ पार, टब पी>> कुंवारी महिलाओं जो फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में FLP व्यक्त, FLP (बैंगनी) के साथ GAL80 पुरुषों FRT साइटों पर पुनर्संयोजन उत्प्रेरित, "बंद" (codon मध्य excising बंद करो , ) लाल, इस प्रकार Gal80 अभिव्यक्ति और जीएमआर Gal4 के दमन के लिए अनुमति देता है. इस फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में neurodegeneration भंडार (w की कमी से सचित्रआंखों में hite डॉट्स).

चित्रा 6
चित्रा 6. एट - FLPx2 रेखा 688A # का उपयोग कर बाहर Gal80 flipping में FINGR विधि के आवेदन एट - FLPx2 लाइन के बीच एक क्रॉस # 688A जीएमआर Gal4, यूएएस - polyQ कुंवारी से F1 संतान, tubP> GAL80 पुरुष. आँख ommatidia के बीच में वर्णक की कमी # 688A लाइन में FLP अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है. इस क्षेत्र में जीएमआर Gal4 Gal80 दमन Gal4 यूएएस polyQ ड्राइव करने के लिए अनुमति राहत मिली थी.

7 चित्रा
7 चित्रा. Gal80 में या बाहर से flipping photoreceptors में Gal4 प्रतिच्छेद में FINGR विधि का आवेदन . ए टब पी> रोक> Gal80 प्रणाली फ्लिप में एक FLP निर्भर तरीके में GAL4 अभिव्यक्ति प्रतिबंधित है . जीएमआर Gal4, यूएएस - polyQ, टब पी> रोक> GAL80 मक्खियों, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं पतित हैं और depigmented (बाएं उड़). EyFLP की शुरूआत के बाद, Gal80 फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में व्यक्त की है, जीएमआर Gal4, जो बारी में अभिव्यक्ति polyQ बंद मुड़ता है और सामान्य आंखों के साथ मक्खियों (सही उड़) का उत्पादन का पूरा दमन में जिसके परिणामस्वरूप बी टब पी Gal80> > फ्लिप. टब प्रणाली से बाहर के रूप में विपरीत फैशन में काम करता है पी> रोक> Gal80 फ्लिप प्रणाली में. टब पी Gal80>> constitutively GAL4 represses और polyQ की अभिव्यक्ति (मक्खी सामान्य आंखों के साथ छोड़ दिया) को दबा. EyFLP की शुरूआत के बाद, Gal80 फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं से बाहर रूप से फ़्लिप किया है, जीएमआर Gal4 के दमन से राहत और अभिव्यक्ति polyQ पर बदल. यह पतित और depigmented आँखों (सही मक्खी) के साथ मक्खियों को जाता है.

Discussion

Gal4/UAS प्रणाली को व्यापक रूप से और सफलतापूर्वक किया गया है विभिन्न जैविक अध्ययन के लिए Drosophilists (; डफी, 2002 ब्रांड और Perrimon, 1993) द्वारा इस्तेमाल किया. तिथि करने के लिए, मक्खी समुदाय प्रमोटर - संचालित और बढ़ाने जाल Gal4 लाइनों के हजारों उत्पन्न किया है. FINGR विधि का एक प्रमुख शक्ति है कि यह Gal4/UAS सिस्टम के साथ संगत है, यह संभव काफी ड्रोसोफिला पढ़ाई में Gal4 की शक्ति का विस्तार कर रही है.

एक FINGR विधि के महत्वपूर्ण अनुप्रयोग ठीक धुन तंत्रिका सर्किट Gal4/Gal80 चौराहे के माध्यम से व्यवहार अंतर्निहित है. इन कार्यों में शामिल हैं, लेकिन, सीखने और स्मृति, प्रेमालाप, नींद, और circadian ताल सीमित नहीं कर रहे हैं हो सकता है. FINGR विधि भी महत्वपूर्ण न्यूरॉन्स कि अल्जाइमर जैसे मानव neurodegenerative रोगों, amyotrophic पार्श्व काठिन्य (ए एल एस), और पार्किंसंस रोग मॉडलिंग में neurodegeneration के लिए प्रवण हैं नक्शे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसी तरह, न्यूरॉन्स या तंत्रिका सर्किट mediating कोकीन, शराब, और अन्य पदार्थ की लत के लिए महत्वपूर्ण के foci FINGR विधि का उपयोग मैप किया जा सकता है. यह नोट किया जाए कि सशर्त Gal4s (Osterwalder एट अल, 2001.. रोमन एट अल, 2001) FINGR विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है क्रम में करने के लिए तंत्रिका सर्किट और व्यवहार के अस्थायी नियंत्रण हासिल. Gal80 परिवर्तित उपकरणों की एक तापमान के प्रति संवेदनशील Gal80 (टीएस Gal80, McGuire एट अल. 2003) का उपयोग करके संशोधन का उत्पादन कर सकते हैं टब पी> रोक> Gal80 टीएस या टब पी> Gal80 टीएस> सर्किट हेरफेर में आगे लौकिक लचीलापन जोड़ने. तंत्रिका तंत्र के अलावा, FINGR विधि कोशिकाओं के सबसेट में Gal4 अभिव्यक्ति है चाहे वह पंख या पैर की है सीमित करने के लिए समान रूप से लागू होता है.

एट - FLPx2 लाइनों सभी ड्रोसोफिला / FRT FLP आधारित clonal (Xu और रुबिन, 1993) विश्लेषण MARCM (ली और लुओ, 1999) सहित, में रुचि रखते हैं जीव के लिए एक मूल्यवान संसाधन हो जाएगा. यह भी उम्मीद है कि कुछ एट FLPx2 लाइनों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य क्लोनों के उत्पादन के लिए और दोहराया morphological और व्यवहार विश्लेषण के लिए heatshock FLP की जगह हो सकता है. बढ़ाने जाल Gal4 लाइनों की तरह, सबसे एट FLPx2 - लाइनों के लिए विशेष रूप से एक ब्याज की कोशिकाओं में व्यक्त होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं. अधिकांश लाइनों ब्याज की कोशिकाओं में और के रूप में अच्छी तरह से अन्य कोशिकाओं या ऊतकों में FLP व्यक्त करेंगे. हालांकि, दोनों Gal4 और एट - FLPx2 ऊतक विशिष्टता 'की कमी FINGR विधि के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय के रूप में लंबे समय के रूप में उनके अतिव्यापी क्षेत्र में एक विशेष प्रयोग के लिए वांछनीय है नहीं किया जाएगा. FINGR एक परिष्कृत एक में दो 'व्यापक' सिस्टम बारी करने के लिए डिज़ाइन किया गया है.

इन प्रोटोकॉल में सचित्र तरीकों के बजाय मानक हैं और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना चाहिए. प्रमुख सजग कदम है कि एक ध्यान की आवश्यकता होती है लगानेवाला का चयन उपयोग कर रहे हैं. पीएफए ​​की तुलना में अन्य Fixatives क्योंकि वे GFP संकेत बुझाने के लिए बचा जाना चाहिए. हम यह भी उल्लेख किया है कि विच्छेदन पकवान पीएफए ​​के साथ नियतन के लिए इस्तेमाल नहीं किया संभावना है कि FLP अभिव्यक्ति मज़बूती GFP द्वारा रिपोर्ट नहीं किया जाएगा से बचने चाहिए.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम ओकलाहोमा के विश्वविद्यालय (BZ के लिए) और एक अनुदान से NSF (IOS 1,025,556, BZ और RAB के लिए) से टीआरएफ, RAB, XP, आओ, MLW, कैस, और इस शोध का समर्थन करने के लिए एक आंतरिक कोष धन्यवाद. एक NIH अनुदान (NS060878 RO1 BZ) RAB आंशिक रूप से समर्थित. RAB एक NIH (T32 NS07292) एनआरएसए प्रशिक्षण अनुदान ब्राण्डैस विश्वविद्यालय के लिए सम्मानित किया गया, और एक NIH अनुदान (RO1 GM21473) ब्राण्डैस में जेफरी हॉल के लिए सम्मानित किया गया, इस अध्ययन के प्रारंभिक अवस्था का समर्थन करने के लिए मानता है. हम इस परियोजना के लिए अपने निरंतर encouragements के लिए जेफरी हॉल धन्यवाद. हम टब पी Gal80>> तनाव के साथ हमें प्रदान करने के लिए डा. क्रिस्टिन स्कॉट धन्यवाद .

References

  1. Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).
  2. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  3. Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila. Development. 134, 1091-1099 (2007).
  4. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. , 34-341 (2002).
  5. Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
  6. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  7. McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
  8. Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
  9. Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
  10. Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).
  11. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).

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तंत्रिका विज्ञान 52 अंक यूएएस Gal4 Gal80 Flippase FRT clonal विश्लेषण व्यवहार ड्रोसोफिला
मानचित्रण और बढ़ाने जाल Flippase अभिव्यक्ति की लारवल और वयस्क में आवेदन<em> ड्रोसोफिला</em> सीएनएस
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Fore, T. R., Ojwang, A. A., Warner,… More

Fore, T. R., Ojwang, A. A., Warner, M. L., Peng, X., Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Bao, H., Zhang, B. Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS. J. Vis. Exp. (52), e2649, doi:10.3791/2649 (2011).

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