Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Summary

Dieser technische Artikel beschreibt eine Standard-Western-Blot-Verfahren unter Verwendung der kommerziell erhältlichen NuPAGE Elektrophorese Mini-Gel-System von Invitrogen.

Abstract

Western Blot (oder Immunoblot) ist ein Standard Laborverfahren erlauben Ermittler auf die Expression eines Proteins zu überprüfen, Bestimmung der relativen Menge des Proteins in verschiedenen Proben und analysieren die Ergebnisse der Co-Immunopräzipitation Experimenten. In diesem Verfahren wird ein Zielprotein mit einem spezifischen primären Antikörper in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt nachgewiesen. Protein Trennung nach Molekulargewicht erfolgt über denaturierende SDS-PAGE. Nach dem Transfer auf eine Membran, wird das Zielprotein mit einem spezifischen primären Antikörper untersucht und nachgewiesen durch Chemilumineszenz.

Seit seiner ersten Beschreibung hat die Western-Blot-Technik eine Reihe von Verbesserungen, darunter Fertiggele und benutzerfreundliche Geräte unterzogen. In unserem Labor haben wir uns entschieden, das im Handel erhältliche NuPAGE Elektrophorese-System von Invitrogen verwendet. Es ist ein innovatives pH-neutral, diskontinuierliche SDS-PAGE, pre-cast Mini-Gel-System. Dieses System bietet mehrere Vorteile gegenüber dem traditionellen Laemmli-Technik einschließlich: i) eine längere Haltbarkeit der Fertiggele von 8 Monaten bis zu 1 Jahr; ii) eine breite Trennung Bereich von Molekulargewichten von 1 bis 400 kDa, abhängig von der Art Gel verwendet werden, und iii) eine größere Vielseitigkeit (Bereich von Acrylamid Prozentsatz, der Art des Gels, und die ionische Zusammensetzung der Laufpuffer).

Das Verfahren in diesem Video Artikel beschrieben nutzt die Bis-Tris diskontinuierlichen Puffersystem mit 4-12% Bis-Tris Gradientengele und MES-Laufpuffer, als Beispiel dafür, wie ein Western-Blot mit Hilfe der Unter Invitrogen NuPAGE Elektrophorese-System. In unserem Labor haben wir eine gute und reproduzierbare Ergebnisse für verschiedene biochemische Anwendungen mit diesem Western-Blot-Methode erhalten.

Protocol

Gel-Elektrophorese Technischer Hinweis: Vor dem Start des Verfahrens haben Sie Ihre Protein-Proben bereit. Während dieses ersten Schritt werden die Proteine ​​in der Probe nach ihrem Molekulargewicht mit denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Die NuPAGE ® LDS-Probenpuffer mit Lithium-Dodecylsulfat (LDS) geladen unterhält Polypeptiden in einem denaturierten Zustand, wenn die Protein-Probe wurde bei <e…

Discussion

Das hier vorgestellte Verfahren verwendet eine Bis-Tris-Gel mit MES-Laufpuffer als ein Beispiel für denaturierende PAGE mit dem Invitrogen NuPAGE Novex Elektrophorese-System. Darüber hinaus ermöglicht diese pre-cast-Gel-System Protein Trennung unter denaturierenden oder nicht denaturierenden Bedingungen sowie Platz für eine breite Palette von Molekulargewichten (1 bis 200 kDa für das Bis-Tris Gele 36-400 kDa für das Tris- Acetat-Gele). Abhängig von Ihrem Experiment, können Sie festlegen, dass nur ein Teil der Western-Blotting hier b…