Summary
يوصف تقنية لقياس استجابة فسيولوجية الجسم الحي من الخلايا العصبية في الثدييات أثناء التنقل والربط بين علم وظائف الأعضاء من الخلايا العصبية مع مورفولوجيا الخلايا العصبية ، والنمط الظاهري الكيميائية العصبية الدارات الدقيقة متشابك.
Abstract
دور الخلايا العصبية الفردية وظيفتها في الدوائر العصبية أمر أساسي لفهم الآليات العصبية من الوظائف الحسية والحركية. معظم التحقيقات آليات الحسية تعتمد على الفحص إما من الخلايا العصبية في حين أن الحيوان هو 1،2 ثابتة أو تسجيل نشاط الخلايا العصبية خارج الخلية أثناء الحركة. 3،4 في حين أن هذه الدراسات قد وفرت الخلفية الأساسية لوظيفة الحسية ، لأنها إما لا تقييم المعلومات الفنية والذي يحدث أثناء الحركة أو محدودة في قدرتها على تميز تماما النمط الظاهري التشريح والفيزيولوجيا والكيميائية العصبية من الخلايا العصبية. ويظهر هنا وهناك تقنية التي تسمح توصيف واسعة من الخلايا العصبية الفردية في الحركة خلال الجسم الحي. ويمكن استخدام هذه التقنية ليس فقط لدراسة الخلايا العصبية الأولية وارد ولكن أيضا لتوصيف العصبونات الحركية والحسية interneurons. في البداية يتم تسجيل رد فعل عصبون واحد باستخدام أساليب الكهربية خلال تحركات مختلفة من الفك السفلي يليها تحديد الحقل تقبلا للعصبون. ثم يتم حقن الخلايا العصبية والتتبع intracellularly في الخلايا العصبية ، ومعالجة الدماغ العصبية بحيث يمكن تصور مع المجهر الضوئي ، والإلكترون أو مبائر (الشكل 1). ومن ثم أعيد بناؤها في التشكل مفصل للعصبون تتميز بحيث يمكن ربط مورفولوجيا الخلايا العصبية مع الاستجابة الفسيولوجية للخلية عصبية (الشكلان 2،3). في هذه الاتصالات هي مفتاح تقدم تفاصيل مهمة ونصائح للتنفيذ الناجح لهذه التقنية. ويمكن تحديد قيمة للحصول على معلومات إضافية من الخلايا العصبية قيد الدراسة من خلال الجمع بين هذه الطريقة مع غيرها من التقنيات. ويمكن استخدام العلامات العصبية الوراء لتحديد الخلايا العصبية التي نهايات الخلايا العصبية المسماة ؛ تقرير مفصل وبالتالي السماح للدوائر العصبية. ويمكن الجمع بين كيمياء سيتولوجية مناعية مع هذا الأسلوب لفحص الناقلات العصبية داخل الخلايا العصبية المسماة وتحديد الظواهر الكيميائية من الخلايا العصبية مع نهايات الخلايا العصبية التي وصفت. ويمكن أيضا أن تكون الخلايا العصبية المسماة المجهزة للالمجهر الإلكتروني لتحديد ملامح التركيبية والدارات الدقيقة من الخلايا العصبية المسماة. عموما هذه التقنية هي وسيلة قوية لتوصيف دقيق خلال الخلايا العصبية في الجسم الحي الحركة مما يتيح رؤية جوهرية في دور الخلايا العصبية في الوظيفة الحسية.
Protocol
1. تحضير الحيوانات
- تخدير الفئران مع الصوديوم بنتوباربيتال (IP 50mg/kg) ووضع على وسادة التدفئة. حلق الجلد المغطي الجمجمة الخلفي مع كليبرز الحيوانية. تحقق للتأكد من أن الحيوان قد تم الحصول عليها على مستوى العمليات الجراحية في مستوى التخدير عن طريق اختبار لعدم وجود منعكس الانسحاب والنطق عند أصابع القدم هي مقروص فضلا عن عدم وجود منعكس الجفن. فحص مستوى التخدير كل 15 دقيقة ، والحفاظ على مستوى العمليات الجراحية في anesthetisa بواسطة الحقن 15mg/kg الصوديوم بنتوباربيتال كل 45 دقيقة.
- استخدام تقنية العقيم وإجراء شق في المنطقة الأربية القاصي فقط إلى تجعد شكلتها البطن والفخذ الداخلية وادخال وقنية (1MM القطر ، كلاي آدمز) في الوريد الفخذي والشريان الفخذي. جعل شق خط الوسط في المنطقة تحت الفك السفلي ، وتعكس العضلات تحت اللامية. إجراء شق صغير في القصبة الهوائية وادخال وقنية (2mm وقطر) للسماح للتهوية. TYE a خياطة حول trachael cannual لضمان الحصول عليها في place.Monitor النظامية ضغط الدم الانبساطي والانقباضي عبر قنية الشرياني. بالإضافة إلى رصد الانسحاب ومنعكس الجفن الآن رصد ضغط الدم لتقييم مستوى التخدير. إدارة التخدير إضافية عند الحاجة عن طريق قنية وريدية.
- وضع الفئران في إطار التجسيمي وتنفيذ حج القحف لفضح المخيخ. إرفاق قنية القصبة الهوائية لجهاز التنفس الصناعي القوارض. تهوية الحيوانية مع حجم 2 سم 3 بمعدل 100/min مع الهواء مرطب. ينبغي الحفاظ على ضغط نهاية الزفير الإيجابي من 1 سم 2 O H لمنع انهيار الرئة. كل 15 دقيقة hyperinflate الرئتين لمنع انخماص. ثم يغطى سطح الدماغ مع الزيوت المعدنية حرارة (30 درجة مئوية). كن حذرا لتجنب الجيب الوريدي كبير يقع مباشرة تحت تقاطع بين الجداري والعظام بين الجداري.
- تنطبق الغراء cyanoacrylate بالإضافة إلى قضيب إلى هزاز كهرومغناطيسي وإرفاق قضيب في انشطار ؛ الفك. نقل إشارات لفك الأوامر باستخدام لهزاز من إما A / D أو الإخراج الكمبيوتر مولد الإشارات.
- وضع أسس والفضة وكلوريد siliver الكهربائي تحت الجلد بالقرب من حج القحف.
2. إعداد القطب
- افتعال microelectrodes من الزجاج أو الكوارتز ألومينوسيليكات باستخدام مجتذب microelectrode الأفقي.
- ملء microelectrode مع biotinamide 5-10 ٪ الذائبة في 0.25M 0.5M بوكل وحمض الهيدروكلوريك تريس العازلة (7.6 درجة الحموضة) أو tetramethlyrhodamine 2 ٪ في المياه المالحة (الرقم الهيدروجيني 6). فحص المعاوقة مع القطب الكهربائي فاحص. سجل لقطر من المحاور الكبيرة تجعل الأقطاب مع مقاومة 60 - 80M Ω ، على المحاور الصغيرة وجعل interneurons الأقطاب مع مقاومة من 150MΩ - 80.
- ضع microelectrode في مرحلة رئيس مقياس الكهربية. تصور القطب من خلال تلسكوب صغير (20X مع شبكاني المغلقة) والذي هو ثابت في موقف وراء رأس الحيوان. باستخدام تلسكوب مهم لأنه يسمح إلكترودين stereotaxically بدقة كبيرة.
3. الكهربية تسجيل وتلطيخ الخلايا
- جعل فتحة صغيرة في الأم الحنون ويعوض ردود الفعل السعة بحيث عند القطب اللمسات الدماغ وينتج إشارة التغذية المرتدة. هذا الموقع يسمح دقيقة من سطح الدماغ.
- إنتاج التشريد ودفع الفك السفلي وكرر القطب في الدماغ مع محرك التنقل.
- تعترف التطويق العصبية بواسطة قطرات المفاجئ في العاصمة المحتملة وتحديد التطويق intrasomatic العصبية حسب النشاط متشابك الجارية. الأز القطب مع الافراط في استغلال السعة أو نادرا ما تسفر عن اختراق خلية ناجحة. بسبب مقاومة عالية من الأقطاب ، ونادرا ما لاحظت الاستجابات العصبية قبل الاختراق.
- بعد أسعد الخلايا العصبيه ويعتبر اختراق مستقر ، توصيف استجابة الخلايا العصبية باستخدام منحدر وعقد والجيبية حركة الفك 5 خريطة الحقل تقبلا من الخلايا العصبية التي تحقق في الجلد حول الرأس وداخل تجويف الفم مع التحقيق الذي تجريه غير موصل مثل عصا خشبية. إذا كان ذلك مناسبا للدراسة ، ودراسة مدى استجابة الخلايا العصبية للمؤثرات الأخرى ذات الصلة وظيفيا مثل تقلص العضلات والمنبهات الضارة. 6 وارد nociceptive الابتدائية المستقبلات العصبية الاستجابة للمحفزات nociceptive. anesthesetics عامة مثل الصوديوم بنتوباربيتال لا تحجب التوصيل المحاور الأساسية في الخلايا العصبية وارد ولكن ليس خفض انتقال متشابك. وبالتالي يتم الحفاظ التوصيل محواري في المحوار العصبية الأولية وارد.
- حقن الحالية (DC ، 1 - 4NA) لفترة الحقن مجموعه 15 70nA دقيقة. مراقبة تسلل الكهربائي خلال الحقن الحالية والمحتملة في حالة التوقف عن الغشاء يصبح أكثر إيجابية مما كان 30mV.
4. معالجة الأنسجة
- الموت ببطء والحيوان جرعة زائدة من بنتوباربيتال (140mg/kg الرابع) ، ويروي مع شطف الأوعية الدموية (0.9 ٪ كلوريد الصوديوم 38 درجة مئوية تحتوي على 500 وحدة من الهيبارين و1ml 2 ٪ تليها xylocaine بارافورمالدهيد 4 ٪ في 0.1M العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) .
- إزالة المخ وذلك في المقطع 100μm - 50 vibratome باستخدام إما في الطائرة ، وأمامي السهمي أو الأفقي. يتم جمع Secions التعويم في 25 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني.
- عملية في الدماغ لDAB التي يحتضنها 1-2 ٪ مصل الماعز العادي و 1 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني 0.01M تليها حضانة في مجمع أفيدين البيوتين (1:50 Vectastain النخبة). تتفاعل المقاطع باستخدام النيكل DAB مع H 2 O 2. لعملية الأحمر ولاية تكساس ، في احتضان المقاطع أفيدين - البيوتين المعقدة (1:50) في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ، واحتضان ثم في 4 ٪ تكساس DCS أفيدين الأحمر في PBST عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ملون مباين المقاطع مع الفلورسنت 20min نيسل (NeuroTrace) وصمة عار على 23 درجة مئوية.
- إذا تم حقن الخلايا العصبية مع رودامين ، تصور الخلية العصبية حقنه مباشرة مع المجهر الفلورسنت (تحويلة 545nm).
5. الجمع بين الأسلوب مع وضع العلامات الوراء ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، والتصوير مبائر ، التحليل الكمي colocalization
نجاح دمج هذه التقنية مع أساليب أخرى تعتمد بشكل كبير على وضع العلامات الجيدة داخل الخلايا.
- تصور الأسلوب هنا يمكن بسهولة دمجها مع وضع العلامات العصبية الوراء. 7-10 للقيام بذلك ، تخدير الحيوان واستخدام الأسلوب العقيم ، حقن التتبع العصبية مثل البيروكسيداز الفجل (20 ٪ الفجل البيروكسيداز. سيغما السادس ، سيغما) و 1 ٪ جرثومة القمح الفجل aggultinated البيروكسيداز (سيغما) في المناطق المستهدفة الطرفية مثل العضلات الماضغة. وسيتم أخذ هذا التتبع العصبية يصل الى محاور عصبية طرفية ونقلها عبر النقل محواري إلى somata العصبون الحركي. لالعضلات الماضغة ، يتم حقن 15μl من التتبع في عضلة باستخدام العقيمة microsyringe ميكروليتر 10. ثم توضع الحيوانات على لوحة التدفئة ومراقبتها حتى تعافى من التخدير ثم توضع في اقفاص من أجل الانتعاش. بعد 24H ، تخدير الحيوانات والخلايا العصبية والفيزيولوجية تميز intracellularly صمة عار لهم. ثم يروي هذا الحيوان على النحو المبين أعلاه وأقسام الأنسجة العملية لوجود HRP باستخدام tetramethylbenzidine (TMB) كما chromagen وتنغستات الصوديوم كعامل استقرار والمكثف مع الكوبالت. تنغستات حل مكان في أقسام الصوديوم 1 ٪ في برنامج تلفزيوني 0.1M (الرقم الهيدروجيني 6.5) وTMB 0.0007 ٪ الذائبة في الايثانول والأسيتون المطلقة في 15 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم تتفاعل أقسام الأنسجة بإضافة 1.0 مل من 0.3 ٪ H 2 O 2 في 100ML حل الحضانة لمدة 60 دقيقة. شطف الأنسجة في برنامج تلفزيوني 0.1M (الرقم الهيدروجيني 6.5) ووضعه في diaminobenzidine 0.05 ٪ (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، والكوبالت 0.02 ٪ ، و 0.01 ٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني 0.1M (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 10 دقيقة. في 37 درجة مئوية. عملية الأنسجة لتصور من الخلايا العصبية حقنوا biotinamide كما هو موضح ووضع تصور للعلاقات القائمة بين الخلايا العصبية الحسية وصفت ومجموعة متنوعة من العصبونات الحركية.
- ويمكن أيضا تقنية هو موضح هنا بسهولة دمجها مع immnocytochemistry. 6 وعلى سبيل المثال ، عملية immunocytochemically الدماغ لsynaptophysin لتحديد بدقة نقاط الاشتباك العصبي داخل الخلايا العصبية المسماة (الشكل 3). للقيام بذلك ، في احتضان أقسام الدماغ الأضداد المضادة للsynaptophysin الماوس (1:10،000) لمدة 2 يوما في 4 درجات مئوية ، واحتضان ثم في مكافحة الفأر FITC (1:400) ل1H عند 23 درجة مئوية.
- الخلايا العصبية المسماة مع علامات الفلورسنت أو المجهزة للتصوير فلوري مثالية للتصوير مبائر. الرقم 3 هو مثال لقسم الضوئية التي تم الحصول عليها مع المجهري متحد البؤر من خلال حبة محور عصبي. (الشكل 3). توليد الخلايا العصبية المسماة الرسوم المتحركة من خلال الحصول على المقاطع البصرية متعددة من خلال الخلايا العصبية المسماة (الشكل 4).
- ويمكن استخدام الخلايا العصبية المسماة مع هذا الأسلوب للتحليل الكمي colocalization. للقيام بذلك ، استخدام ماكرو البرمجيات المتاحة علنا بالتعاون مع المعاهد الوطنية للصحة صورة (وجدت في http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). توطين synaptophysin داخل المحطات محوار واحد عن طريق الجمع بين العلامات الخلايا مع كيمياء سيتولوجية مناعية synaptophysin 6
6. ممثل النتائج :
وتتضح نظرة عامة على نتائج ممثلة التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب في الشكل 1. كانت الاستجابة لهذه الخلايا العصبية (الشكل 1 اليسرى السفلى ، الضوء الأزرق) تم تسجيلها electrophysiologically هذا واحد عصبون الدماغ أثناء حركة الفك السفلي ، وكما يمكن أن نرى بوضوح ، التضمين أثناء الحركة. تم حقن هذه الخلايا العصبية مع biotinamide بعد توصيف الكهربية ومعالجتها في وقت لاحق عن التصور. يمكن للعصبون بناؤها (الشكل 1 المتوسطة ، أخضر) أن يكون حقيقياتيد إلى المعالم التشريحية ، في هذه الحالة المعينة نواة المحرك الثلاثي التوائم (مخطط الحمراء). يمكن أن يستند إلى استجابة الخلايا العصبية أثناء الحركة والتعمير يتم تحديد هذه الخلايا العصبية والخلايا العصبيه المغزل العضلي الثانوية وارد. ويوضح الشكل 2 مثالا ممثل الاستجابة الفسيولوجية للخلية عصبية أثناء النزوح الفك. وتمثل استجابة الخلايا العصبية وتيرة اطلاق النار الفوري. علما أن الاستجابة العصبية يحاكي بشكل وثيق التشريد الفك مشيرا إلى أن هذه الخلايا العصبية الحسية خاص يوفر التغذية الراجعة ذات الصلة لوضع الفك السفلي. الشكل 3 هي صورة تضخم عالية من محور عصبي ملطخة intracellularly جنبا إلى جنب مع تلوين وصمة عار للsynaptophysin a نيسل. لاحظ colocalization من synaptophysin (الصفراء) داخل حبة محوار. الشكل (4) هو الرسوم المتحركة من خلية عصبية واحدة ، تتميز من الناحية الفسيولوجية وصفت intracellularly.
الشكل 1. نظرة عامة على الأسلوب. العلوي الأيسر : النزوح الفك السفلي. بين الخلايا تسجيل الأوسط (الأخضر) واحد من الخلايا العصبية (الصفراء). أعيد بناؤها في التشكل من هذه الخلايا العصبية بعد تسجيل داخل الخلايا وحقن. مخطط الحمراء يشير موقع نواة المحرك الثلاثي التوائم. اليسرى السفلى : الاستجابة الفسيولوجية لهذه الخلايا العصبية أثناء حركة الفك.
الشكل 2. الاستجابة الفسيولوجية ممثل إحدى الخلايا العصبية الحسية عضلة واحدة سجلت في الجسم الحي أثناء حركة الفك السفلي. لاحظ التشابه في استجابة الخلايا العصبية مع التشرد الفك.
الشكل 3. الطرفية تشجر محواري متشابك مع حبات (تورمات حمراء) من خلية عصبية intracellularly الملطخة الحسية التي استجاب بها أثناء التحقيق في العضلات. تجهيز immunocytochemical اللاحقة لتوطين synaptophysin يظهر synaptophysin داخل حبة محواري (الصفراء). الأخضر هو نيسل الفلورسنت وصمة عار.
الشكل 4. رسوم متحركة من العضلات المغزل الابتدائية محوار عصبون وارد الاستجابة الفيزيولوجية التي تم تسجيلها في الجسم الحي أثناء حركة الفك السفلي ، وكان محور عصبي الملون ثم intracellularly ومعالجتها للالتصور.
تحميل الفيديو عالية الدقة من هنا الشكل 4
تحميل الفيديو القرار المتوسطة من هنا الشكل 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتضح الأسلوب هنا هو أسلوب القوية التي توفر نظرة متبصرة في وظيفة الخلايا العصبية واحد ، وكيف أن استجابة الخلايا العصبية الفردية يساهم في الدوائر العصبية 9 هذه المعرفة أمر أساسي لفهم الوظيفة الحسية. أعظم قوة هذا الأسلوب هو أن يسمح بتحديد عدد كبير من المعلمات حول الخلايا العصبية بما في ذلك علم وظائف الأعضاء ، والتشكل مورفولوجيا متشابك والتوزيع. عند دمجها مع تقنيات أخرى مثل وضع العلامات العصبية الوراء معلومات إضافية مثل الدارات العصبية يمكن وصفها. 7،8 وهناك ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو أنه يمكن تعلمها في الخطوات التالية. على سبيل المثال ، يمكن أن تتم داخل الخلايا تسجيل في البداية ، يليه تلطيخ الخلايا مع كيمياء سيتولوجية مناعية أو العلامات العصبية إلى الوراء وأضاف بعد التمكن من الأسلوب الأول. ربما كان أكبر من الحد من هذه التقنية هو أنه يمكن أن توصف سوى عدد قليل من الخلايا العصبية في أية تجربة واحدة. عادة ما وصفت في البداية 2-3 من الخلايا العصبية اكتب فسيولوجية معينة. مرة واحدة وضعت العلاقة المحتملة بين الفيزيولوجيا وعلم التشكل ، وتستخدم مزيد من التجارب للتأكد من هذه العلاقة بدقة في التجارب التي تتم تسمية فقط عصبون واحد.
الخطوة الأكثر أهمية لنجاح هذا الأسلوب هو الحفاظ على الاستقرار تسجيل الكهربية داخل الخلايا. إن الاستقرار تسجيل تختلف اختلافا كبيرا تبعا للموقع داخل الدماغ من الخلايا العصبية قيد الدراسة ولكن يمكن استخدام عدد من المعالجات لزيادة الاستقرار التسجيل. يمكن إجراء استرواح والحيوان التهوية بشكل مصطنع للحد من نبضات الجهاز التنفسي. ويمكن زيادة مزيد من الاستقرار من خلال تطبيق الضغط الايجابي نهاية الزفير من حوالي 1 سم 2 O. H عند الوصول إلى المنطقة ذات الاهتمام داخل الدماغ ، يمكن تعزيز الاستقرار من خلال المتنافسة الحيوان من خلال خفض حجم الجهاز التنفسي وزيادة معدل التنفس. وقد طبقت بعض الدراسات الكهربية آغار دافئة على الدماغ ومقنى المثانة ، وهذه الإجراءات لم تكن فعالة في زيادة الاستقرار تسجيل العصبية في الدماغ. ومن المهم أن نشير إلى أن الحقن مرة لا تحتاج إلى أن تكون طويلة. ويمكن الحصول على نتائج جيدة مع أوقات حقن حوالي 5 دقائق. نظرا لحجم صغير من طرف microelectrodes ، كسر القطب داخل الدماغ عادة لا تنتج بيان كبير من التتبع. ولذلك يمكن الاستعاضة عن القطب والخلايا العصبية بنجاح وسجلت الملون داخل ميكرون عدة مئات من مكان الكسر الكهربائي. إذا كان انسداد القطب أو الحل لا تملأ تسجيل غيض من القطب على نحو كاف ، سيتم زيادة كبيرة في الضوضاء وينبغي الاستعاضة القطب. اختبار مقاومة الكهربائي قبل الإدراج في الدماغ الكهربائي يقلل إلى حد كبير مساحات غير منتجة وتوفير الوقت. إذا كنت تحاول سجل من منطقة صغيرة في الدماغ لتحديد المواقع التجسيمي هو الهدف الأسمى. يمكنني استخدام التلسكوب تعلق على طاولة التسجيل للحفاظ على الصفر الثابتة التجسيمي. التلسكوب مفيد جدا لأنه يمكن أن يوضع القطب الكهربائي في حامل تعلق على طاولة التسجيل ثم ينظر تحت التكبير. يسمح هذا الموضع دقيقة جدا من microelectrode والتصفير من الأقطاب الكهربائية الاستبدال.
وقد استخدم عدد من الدراسات الحديثة العلامات العصبية juxtacellular. إخراج 11،12 بهذه الطريقة يتم وضع قطب كهربائي في القرب من إحدى الخلايا العصبية على أساس خصائص تسجيل العصبية والتتبع العصبية. مشكلة محتملة واضحة مع هذا الأسلوب هو وضع العلامات الزائفة منذ يمكن إدراجها في التتبع والتشعبات المحاور الأخرى من الخلايا العصبية في المناطق القريبة من القطب. بالإضافة ، لا يمكن أن العلاقات بين المدخلات والمخرجات من الخلايا العصبية يمكن تحديدها بسبب يمكن توليد إمكانات العمل المسجلة خارج الخلية ليس فقط عن طريق إدخال متشابك إلى الخلايا العصبية ولكن عن طريق خصائص ذاتية في الخلايا العصبية. مع أسلوب ذكرت هنا ، وصفت الخلايا العصبية فقط بينما هو في الواقع microelectrode داخل الخلايا العصبية ، وبالتالي ليس هناك أي غموض بشأن إسناد نشاط الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية الملون. هذا مهم بشكل خاص عند وضع العلامات المحاوير لأن حركة microelectrode من النتائج ميكرون قليلة في وضع العلامات الزائفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تسجيل الأحداث دون العتبي بما في ذلك إمكانات متشابك من الخلايا العصبية مخوزق.
ويمكن الجمع بين الدراسات المستقبلية مع هذا الأسلوب أثار حركات. على سبيل المثال يمكن تحفيز حركات المضغ تستثير القشرية والاستقرار داخل الدماغ تسجيل يجب السماح تسجيل داخل الخلايا والخلايا العصبية من خلال تلطيخ هذه الحركات أثار. منذ يمكن القيام به هذه التقنية مع الحد الأدنى من التدخل الجراحي ، قد يكون أيضا possible لاستخدام هذه الطريقة لإدخال المواد التي تغير الجينات في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للإرشادات والتنظيم المنصوص عليها في دليل لرعاية واستخدام حيوانات المختبرات (NIH المنشور رقم 86-23 ، منقحة 1985) وجامعة ميريلاند رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
Acknowledgments
أشكر انتوني تايلور لتدريب أولي في داخل الخلايا الحية في تسجيل وماكسويل وبراون وديفيد للمساعدة في التطوير الأولي للتقنية تلوين داخل الخلايا. أشكر السيد فضة للمساعدة في الماكرو collocalization. كثير من العلماء الذين تعاونت أنا قدمت رؤية في تطوير هذه التقنية بما في ذلك دونجا R. ، Moritani M. ، P. لوه ، Ambalavanar ر. وقد تم تطوير هذه التقنية مع دعم كبير من المعاهد الوطنية للصحة DE10132 المنح ، وDE15386 RR017971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
- Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
- Frigon, A., Gossard, J. Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord. J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).
- Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching. J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).
- Ma, C., He, J. A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys. J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).
- Dessem, D., Donga, R., Luo, P. Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions. J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).
- Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).
- Luo, P., Dessem, D. Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular. J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).
- Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).
- Luo, P., Wong, R., Dessem, D. Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide. J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).
- Luo, P., Dessem, D. Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat. J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).
- Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep. Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).
- Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum. Neuroscience. 168, 395-404 (2010).
