Summary
テクニックは運動中に哺乳類の神経細胞の生体内生理的反応の定量化と神経形態、神経化学的表現型とシナプス超小型回路とニューロンの生理学を相互に関連付ける説明されています。
Abstract
個々の神経細胞と神経回路におけるそれらの機能の役割は、感覚と運動機能の神経機構を理解する上での基本です。動物が運動中に静的1,2または記録細胞外神経活動のときに感覚運動メカニズムのほとんどの研究は、神経細胞のいずれかの検査に依存しています。3,4これらの研究は、感覚運動機能のための基本的な背景を提供しているが、彼 らはどちらかの機能的な情報を評価しないこれは、運動中に発生した場合、または完全にニューロンの解剖学、生理学、神経化学的表現型を特徴づけるために彼らの能力は限られています。技術は生体の運動の中に個々のニューロンの大規模な特性評価を可能にするここに示されています。この手法は、一次求心性神経細胞を研究するだけでなく、運動ニューロンと感覚運動の介在を特徴づけるためにだけ使用できます。最初に単一ニューロンの応答は、ニューロンの受容野の決定に続いて下顎骨の様々な動きの間に電気生理学的手法を用いて記録されます。神経トレーサーは、細胞内ニューロンに注入され、脳は、ニューロンが光、電子または共焦点顕微鏡（図1）可視化できるように処理されます。神経形態はニューロン（図2,3）の生理的応答と相関させることができるように特徴づけられる神経細胞の詳細な形態は、再構築されます。この通信ではこの手法の実装を成功させるための重要なキーの詳細とヒントが提供されています。貴重な追加情報は、他の技術とこの手法を組み合わせることにより、研究対象のニューロンのために決定することができます。逆行性神経標識は、標識されたニューロンのシナプスなるとニューロンを決定するために使用することができる、従って神経回路の詳細な測定を可能にします。免疫細胞は標識されたニューロン内の神経伝達物質を調べ、設定されたラベル付きニューロンのシナプスニューロンの化学的表現型を判定するために、このメソッドと組み合わせることができます。標識されたニューロンは、超微細構造の特徴とラベルされたニューロンの超小型回路を決定するために電子顕微鏡のために処理することができます。全体的にこのテクニックは、徹底的にこのように感覚運動機能におけるニューロンの役割にかなりの洞察を可能にする生体運動の中に神経細胞を特徴づけるために強力な方法です。
Protocol
1。動物の準備
- ペントバルビタールナトリウム（50mg/kg IP）と加熱パッド上の場所でラットを麻酔。動物のバリカンで後部頭蓋骨を覆う皮膚を剃る。麻酔のレベルの手術レベルはつま先を挟まないだけでなく、眼瞼反射欠如である場合撤退の反射や発声の有無をテストすることによって得られていることを保証するために動物を確認してください。麻酔15分ごとのレベルを確認し、ペントバルビタールナトリウム15mg/kgの注射は45分ごとでanesthetisaの外科的レベルを維持する。
- 無菌操作を使用し、腹部と太ももの内側で形成された皺に鼠径部の切開だけで遠位にし、大腿静脈にカニューレ（1ミリメートル直径、クレイアダムス）、および大腿動脈に挿入する。顎下部の正中切開を行う、舌骨下筋を反映している。気管に小さな切開を行い、換気を可能にするカニューレを（直径2mm）を挿入します。動脈カニューレを介してplace.Monitor全身収縮期血圧および拡張期血圧でそれを確保するcannual trachael周り縫合糸をTYE。撤退と眼瞼反射の監視に加えて、今麻酔のレベルを評価するために血圧を監視する。静脈カニューレを介して必要なときに追加の麻酔を管理します。
- 定位フレームにラットを置いて、小脳を露出させる開頭術を行います。齧歯類の人工呼吸器に気管カニューレを取り付けます。加湿空気と100/minの割合で2 cm 3の体積で動物を換気する。 1センチメートルH 2 Oの正側呼気圧力は肺の虚脱を防ぐために維持されるべきである。 15分ごとに無気肺を防ぐために、肺に超インフレにする。その後、温めたミネラルオイル（30℃）で脳の表面を覆う。直接壁と壁間の骨の間の接合部の下にある大静脈洞を避けるように注意してください。
- 電磁振動に結合ロッドにシアノアクリレート接着剤を適用すると顎の正中離開でロッドを取り付けます。どちら/ Dコンピュータの出力または信号発生器から振動子に下顎を使用してコマンド信号を移動します。
- 開頭術に隣接して皮膚の下に電極を接地siliver - 塩化銀を置きます。
2。電極の準備
- 水平方向の微小電極プラーを使用して石英やアルミノシリケートガラスから微小電極を作製。
- 0.25M KClおよび0.5Mトリス塩酸緩衝液（pH7.6）または生理食塩水で2％tetramethlyrhodamine（pHは6）に溶解した5〜10％のbiotinamideに微小電極を埋める。電極のテスターと電極のインピーダンスを確認してください。大径の軸索から記録するには60 - 80MΩのインピーダンスを持つ電極を作る、小さな軸索および介在、80 -150MΩのインピーダンスと電極を作る。
- エレクトロメータのヘッドステージに微小電極を配置。動物の頭の後ろの位置に固定されている小さな望遠鏡（同封のレチクル付き20X）を介して電極を視覚化する。それは電極を定位を高い精度で配置されることができるため、望遠鏡を使用することが重要です。
3。電気生理学的記録と細胞内染色
- 軟膜の小さな開口部を作成し、電極が脳に触れるとフィードバック信号が生成されるように容量のフィードバックを過度に補償する。これは、脳の表面の正確な位置を可能にします。
- 繰り返される下顎変位を生成し、ステッピングモータと、脳に電極を進める。
- 直流電位の急激な低下によって神経impalementsを認識し、継続的なシナプス活動によってintrasomatic神経impalementsを識別する。静電容量の過補償と電極を賑わっまたはめったに成功した細胞の浸透を生成しないタップ。ため、電極の高インピーダンスから、神経細胞応答はほとんど浸透する前に観察されない。
- あなたがニューロンを突き刺すと浸透が安定したと判断された後、ランプとホールドと正弦波顎の動きを使って神経細胞の応答を特徴付ける。マップ5ニューロンの受容野を非導電性プローブを用いて頭の周りの皮膚と内口腔をプローブすることにより木の棒など。研究に関連する場合、そのような筋収縮や侵害刺激のような他の機能的に関連刺激に対するニューロンの応答を調べて6一次求心性侵害受容ニューロンの受容体は、侵害刺激に応答する。ペントバルビタールナトリウムのような一般的なanestheseticsは、一次求心性ニューロンの軸索の伝導をブロックするのではなく、シナプス伝達を抑制することはありません。したがって、一次求心性神経細胞軸索の軸索伝導が維持されます。
- 15 70nA分の総噴射時間のために（DC、1 - 4NA）電流を注入。電流注入時の電極の侵入を監視し、膜電位が- 30mVのより肯定的になれば中止する。
4。組織の処理
- リンス血管にペントバルビタールの過剰投与（140mg/kg IV）と浸み込ませることにより動物を安楽死させる（0.9％塩化ナトリウム38℃ヘパリンと1ミリリットルの2％のCを含む500台を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドに続いてキシロカイン。
- それはどちらの正面、矢状または水平面でビブラトームを用いて50 -100μmの時に脳やセクションを削除します。 Secionsは25℃のPBSで自由に浮遊して収集されます。
- 1から2パーセント正常ヤギ血清でインキュベートすることによりDABのための脳、1％トリトンX - 100、0.01M PBSでの処理アビジンビオチン複合体（1:50エリートステイン）でインキュベートした。 H 2 O 2とニッケル- DABを使用してセクションを反応する。テキサスレッド、4℃で一晩、PBSのアビジン - ビオチン複合体（1:50）で切片をインキュベート℃、その後4℃で一晩PBSTで4％テキサスレッドアビジンDCSでインキュベート。ために処理するために23℃で蛍光ニッスル染色（NeuroTrace）20分で切片を対比
- ニューロンは、ローダミンで注入した場合、蛍光顕微鏡（例545nm）を直接注入ニューロンを可視化する。
5。逆行性標識法と組み合わせる方法、免疫細胞化学、共焦点イメージング、定量的局在解析
他の方法でこの手法を組み合わせるの成功は、優れた細胞内ラベリングに大きく依存します。
- 方法は簡単に逆行性神経細胞のラベリングと組み合わせることができますここで可視化した。これを行うには7-10、動物を麻酔し、無菌操作を使用して、このような西洋ワサビペルオキシダーゼ（20％西洋ワサビペルオキシダーゼ。シグマVI、シグマ）などの神経トレーサーを注入し、1％小麦胚芽は、咬筋などのペリフェラルターゲット領域に西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma）をaggultinated。このニューロントレーサーは、末梢軸索に取り込まと運動ニューロンのsomaの複数形に軸索輸送を介して輸送されます。咬筋の場合は、トレーサーの15μlの滅菌10マイクロリットルのマイクロシリンジを用いて筋肉に注入されます。麻酔から回復し、回復のために自分のケージの中で供されるまで、動物を加熱パッド上に配置して監視されます。 24時間後、動物を麻酔し、生理学的に神経細胞を特徴づけ、細胞内でそれらを染色。その後、コバルトと安定剤や強化などのchromagenとタングステン酸ナトリウムとしてテトラメチルベンジジン（TMB）を使用して、HRPの存在のために上記のように動物やプロセスの組織切片を灌流。 1％ナトリウムの場所のセクションを0.1M PBS（pH6.5）で、15で無水エタノールやアセトンに溶解した0.0007％TMBに溶解し、タングステン酸℃で20分間。て0.3％60分間インキュベーション溶液の100mlあたりH 2 O 2の1.0mlを添加することにより組織切片を反応する。 0.05％ジアミノベンジジン液（pH7.4）、0.02％、コバルト、及び0.01％H 2 10分間0.1M PBS（pH7.4）中のO 2で0.1M PBS（pH6.5）での組織や場所をすすぎます。 37℃説明されているようbiotinamideを注入されたニューロンの可視化のための組織を処理し、標識の感覚ニューロンと運動ニューロンの様々な間の関係を視覚化する。
- ここに示されているテクニックも容易にimmnocytochemistryと組み合わせることができます。6例として、免疫細胞化学的に正確にラベルされたニューロン内のシナプス（ 図3）を見つけるためにシナプトフィジンのための脳の処理。これを行うには、4℃で2日間C、その後23℃1時間のために抗マウスFITC（1:400）でインキュベーション℃でマウス抗シナプトフィジン抗体（1:10,000）の脳切片をインキュベート
- 蛍光マーカーで標識または蛍光イメージングのために処理のニューロンは、共焦点イメージングに最適です。図3は、軸索のブートンを通じて共焦点顕微鏡で得られた光学部の一例です。 （ 図3）。ラベル付けニューロン（ 図4）を介して複数の光のセクションを取得することにより標識されたニューロンのアニメーションを生成する。
- この方法で標識されたニューロンは、定量的局在の解析に使用することができます。これを行うには、NIHイメージ（http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htmで発見）と一緒に公開されているソフトウェアのマクロを使用してください。シナプトフィジン免疫細胞との細胞内のラベルを結合して単一の軸索終末内シナプトフィジンをローカライズする。6
6。代表的な結果：
この方法を使用して取得することができる代表的な結果の概要を図1に示します。この単一の脳幹ニューロンが電気生理学的に明確に見られるように、下顎運動中に記録していた、このニューロンの応答（ 図1左、水色下）が運動中に変調だった。このニューロンは電気生理学的特性評価後にbiotinamideを注入し、続いて視覚化のために処理した。再構築されたニューロン（ 図1中央の、緑色は）本当のことができます解剖学的ランドマーク、この場合には三叉神経運動核が指定（赤枠）のテッド。運動と再構成するときに、神経細胞の応答に基づいて、このニューロンは二筋紡錘求心性ニューロンとして同定することができる。 図2は、顎の変位時のニューロンの生理学的応答の代表的な例を示します。ニューロンの応答は瞬時発火頻度として表されます。神経細胞の応答が密接にこの特定のニューロンは下顎の位置に関連した感覚フィードバックを提供することを示す下顎変位を模倣している。 図3は、ノートでは、シナプスの染色とニッスル染色と組み合わせて細胞内で染色された軸索の高倍率の画像です。軸索神経繊維末端内シナプトフィジン（黄色）の共局在を注意してください。 図4は、シングル、生理学的特徴および細胞内に標識されたニューロンのアニメーションです。
図1の方法の概要。左上：下顎の変位。単一のニューロン（黄色）から中央の細胞内記録（緑）。このニューロンの形態は、細胞内記録と注射後に再建されました。赤いアウトラインは三叉神経運動核の位置を示します。左下：顎運動時に、このニューロンの生理学的な応答を。
図2下顎運動中に生体内で記録された単一の筋肉感覚神経の代表的な生理的反応。顎の変位と神経細胞応答の類似性に注意してください。
プロービング筋肉中に応答した細胞内染色の感覚ニューロンのシナプスboutons（赤い腫れ）と図3。ターミナル軸索分岐。シナプトフィジンの後続免疫細胞化学的処理は、軸索ブートン（黄色）内のシナプトフィジンの局在を示しています。グリーンは蛍光ニッスル染色です。
図4。生理反応下顎運動時の生体内で記録された筋紡錘一次求心性ニューロンの軸索のアニメーションは、軸索は、細胞内染色し、可視化のために処理した。
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Discussion
ここに示した方法は、単一ニューロンの機能に重要な洞察を提供し、どのように個々のニューロンの応答は、神経回路に貢献する強力な手法です。9この知識は、感覚運動機能を理解する上での基本です。この手法の最大の強みは、生理学、形態とシナプス形態と分布を含むニューロンに関する多数のパラメータの決定を可能にされているです。そのようなような神経回路のような逆行性神経標識の追加情報など、他の手法と組み合わせることで、特徴づけることができる。この方法の7,8別の利点は、ステップで学習できることです。例えば、細胞内記録は、免疫細胞や初期メソッドの習得後に追加された逆行性神経標識と細胞内染色に続いて、最初に行うことができる。おそらく、技術の最大の制限は、神経細胞の数が少ないがいずれの実験で標識することができるということです。通常、特定の生理型の2〜3のニューロンは、最初に表示されています。生理学と形態との間の潜在的な関係が定式化されると、追加の実験は慎重にのみ、単一のニューロンが標識されている実験ではこの関係を確認するために使用されます。
この方法の成功の最も重要なステップは、電気生理学的細胞内記録の安定性を維持しています。記録の安定性が検討されてニューロンの脳内での位置に応じて大きく異なりますが操作の数は、記録の安定性を向上させることができます。気胸を行い、動物が人工的に呼吸脈動を低減するため換気することができます。安定性は約1 cm H 2 Oの正側呼気圧力を加えることによって、さらに増加することができます脳内の関心領域に到達すると、安定性は、呼吸量が減少し、呼吸数を増やすことによって、過呼吸で動物を高めることができる。いくつかの電気生理学的研究は、脳を介して暖かい寒天を適用し、膀胱をカニューレを挿入している、これらの手順は、脳幹の神経細胞記録の安定性向上に効果的ではなかった。注入時間が長くなる必要がないことを指摘することが重要です。良好な結果が約5分の噴射時間で得ることができる。微小電極の小さいチップサイズのため、脳内に電極の破損は、通常、トレーサーの大量放出を生成しません。したがって、電極を交換することができますし、神経細胞は、正常に記録され、電極の破損の場所の数百ミクロンの範囲内染色。電極が詰まってたり、録音ソリューションが適切に電極の先端を埋めていない場合は、ノイズが大幅に増加され、電極を交換する必要があります。脳内に挿入する前に電極のインピーダンスをテストすることは非常に非生産的な電極のトラクトを軽減し、時間を節約できます。あなたは、脳定位固定位置の小さな領域から録音しようとしている場合は最優先事項です。私は固定された定位ゼロを維持するために記録表に添付された望遠鏡を使用してください。電極は、記録表に添付して、倍率で観察電極ホルダーに配置することができますので、望遠鏡は非常に便利です。これは、交換用電極の微小電極とゼロの非常に正確な配置を可能に。
最近の研究の数はjuxtacellular神経ラベルを使用している。電極が神経細胞記録と神経トレーサーの特性に基づいてニューロンの近傍に配置されているこの方法では11,12が排出されます。トレーサーは、電極の近傍に他のニューロンの樹状突起と軸索に組み込むことができますので、この方法で明らかな潜在的な問題は、スプリアスラベルです。細胞外記録した活動電位がだけではなくニューロンへのシナプス入力によってではなく、ニューロンの本質的な特性によって生成することができるのでさらに、ニューロンの入出力関係を決定することができない。微小電極は、ニューロン内に実際にあるため、染色されたニューロンにニューロン活動の帰属に関する曖昧性がない間、ここに報告された方法で、神経細胞にのみ表示されています。スプリアスラベルは、数ミクロンの結果により、微小電極の動きのため軸索にラベルを付ける際に、これは特に重要です。さらに、シナプス電位を含むサブスレッショルドイベントがimpaledニューロンから記録することができます。
今後の研究では、誘発運動してこのメソッドを組み合わせることができます。例えば、皮質刺激は、これらの誘発運動時のニューロンの細胞内記録と染色を許可する必要が脳幹内で咀嚼運動と記録安定性を呼び起こすことができる。この技術は、最小限の外科的介入を行うことができますので、それはまた、洗濯棒で洗う場合がありますin vivoでの遺伝子発現を変化させる物質を注入するためにこのメソッドを使用するコンパチブル。
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Disclosures
動物実験は、実験動物の管理と使用に関するガイドに記載されているguidlinesと規則に従って（NIH出版番号86から23まで、1985年改訂）とメリーランド州の動物実験委員会の大学で行われた。
Acknowledgments
私は 、in vivo細胞内記録と細胞内染色の技法の初期の開発に関するヘルプは、ブラウンとDavid Maxwell ので最初の訓練のためにアンソニーテイラーに感謝。私はcollocalizationマクロのヘルプはM.シルバーに感謝。多くの学者は、誰と私はR.東亜、M.森谷、P.羅、R. Ambalavanarを含むこの技術の開発に提供する洞察力を協力してきました。この手法は、NIHの助成金DE10132、DE15386とRR017971からかなりのサポートと開発されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
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