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Neuroscience

Caracterização fisiológica, morfológica e neuroquímicos de Neurônios Modulada por Movimento

doi: 10.3791/2650 Published: April 21, 2011

Summary

A técnica é descrita para quantificar a resposta fisiológica em vivo dos neurônios de mamíferos durante o movimento e correlacionar a fisiologia do neurônio com a morfologia neuronal, fenótipo neuroquímico e microcircuitos sináptica.

Abstract

O papel dos neurônios individuais e sua função nos circuitos neuronais é fundamental para a compreensão dos mecanismos neuronais das funções sensoriais e motoras. A maioria das investigações de mecanismos sensório-motor dependem, quer o exame de neurônios ao mesmo tempo um animal é 1,2 estática ou atividade neuronal registro extracelular durante um movimento. 3,4 Embora esses estudos forneceram a base fundamental para a função sensório-motor, que não quer avaliar as informações funcionais que ocorre durante um movimento ou estão limitados na sua capacidade de caracterizar plenamente o fenótipo anatomia, fisiologia e neuroquímica do neurônio. A técnica é mostrada aqui, que permite a caracterização extensa de neurônios individuais durante um em movimento vivo. Esta técnica pode ser usada não só para estudar neurônios aferentes primários, mas também para caracterizar os motoneurônios e interneurônios sensório-motor. Inicialmente, a resposta de um único neurônio é gravado usando métodos eletrofisiológicos durante vários movimentos da mandíbula seguido por determinação do campo receptivo para o neurônio. Um traçador neuronal é, então, intracelularmente injetado no neurônio e do cérebro é processada de modo que o neurônio pode ser visualizado com microscopia de luz, elétron ou confocal (Fig. 1). A morfologia detalhada do neurônio é caracterizado depois reconstruída de modo que a morfologia neuronal pode ser correlacionada com a resposta fisiológica do neurônio (Figs. 2,3). Nesta comunicação detalhes importantes e dicas importantes para a implementação bem sucedida dessa técnica são fornecidos. Informações adicionais valiosas pode ser determinada para o neurônio em estudo através da combinação deste método com outras técnicas. Rotulagem neuronal retrógrada pode ser utilizada para determinar os neurônios com que as sinapses dos neurônios rotuladas, permitindo assim a determinação detalhada dos circuitos neuronais. Imunocitoquímica pode ser combinado com este método para examinar neurotransmissores no neurônio rotulados e para determinar os fenótipos químicos de neurônios com que as sinapses dos neurônios marcados. O neurônio marcado também podem ser processados ​​para microscopia eletrônica para determinar as características ultra-estruturais e micro circuitos do neurônio rotulados. Geral esta técnica é um método poderoso para caracterizar completamente os neurônios durante em movimento vivo, permitindo assim uma visão substancial sobre o papel do neurônio em função sensório-motor.

Protocol

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1. Preparação dos animais

  1. Anestesiar ratos com pentobarbital sódico (50mg/kg IP) e coloque sobre uma almofada de aquecimento. Raspar a pele que recobre o crânio posterior com clippers animal. Verifique o animal para assegurar que um nível cirúrgica do nível de anestesia foi obtida por meio de testes para a ausência de um reflexo de retirada e vocalização quando os dedos são comprimidos, bem como a ausência de reflexo palpebral. Verificar o nível de anestesia a cada 15 minutos e manter um nível cirúrgico de anesthetisa por injeções de pentobarbital sódico 15mg/kg a cada 45 minutos.
  2. Use uma técnica asséptica e fazer uma incisão na região inguinal imediatamente distal à prega formada pelo abdômen e parte interna da coxa e inserir uma cânula (1mm de diâmetro, Clay Adams) na veia femoral e da artéria femoral. Faça uma incisão mediana na região submandibular, refletem os músculos infra-hióideos. Fazer uma pequena incisão na traquéia e inserir uma cânula (2mm de diâmetro) para permitir a ventilação. Tye uma sutura em torno do trachael cannual para fixá-lo na pressão arterial sistêmica place.Monitor sistólica e diastólica através da cânula arterial. Além de monitorar a retirada e reflexo palpebral agora monitor de pressão arterial para avaliar o nível de anestesia. Administrar anestesia adicionais quando necessário através da cânula venosa.
  3. Coloque o rato em uma moldura estereotáxica e realizar uma craniotomia para expor o cerebelo. Anexar a cânula traqueal a um ventilador de roedores. Ventilar o animal com um volume de 2 cm 3 a uma taxa de 100/min com ar umidificado. A pressão expiratória final positiva de 1 cm H 2 O deve ser mantida para evitar o colapso do pulmão. A cada 15 minutos hyperinflate dos pulmões para prevenir atelectasias. Em seguida, cobrir a superfície do cérebro com óleo mineral aquecido (30 ° C). Tenha cuidado para evitar o seio venoso grande localizado diretamente sob a junção entre o parietal e ossos interparietal.
  4. Aplique cola de cianoacrilato a uma haste acoplada a um vibrador eletromagnético e anexar a vara no diastema da mandíbula. Mover a mandíbula sinais de comando usando o vibrador de qualquer um A saída do computador / D ou um gerador de sinal.
  5. Coloque um siliver-prata cloreto de eletrodo de aterramento sob a pele adjacente à craniotomia.

2. Preparação do eletrodo

  1. Fabricar microeletrodos de vidro de quartzo ou de alumínio usando um extrator de microeletrodos horizontal.
  2. Preencher o microeletrodo com biotinamide 5-10% dissolvido em 0,25 m e KCl 0.5M Tris HCl (pH 7,6) ou tetramethlyrhodamine 2% em solução salina (pH 6). Verificação da impedância eletrodo com um testador de eletrodo. Para gravar a partir de axônios de grande diâmetro tornar eletrodos com uma impedância de 60-80M Ω, por axônios de pequeno e interneurônios fazer eletrodos com impedância de 80 150MΩ.
  3. Coloque o microeletrodo no palco cabeça do eletrômetro. Visualize o eletrodo através de um pequeno telescópio (20x com retículo em anexo) que é fixado na posição atrás da cabeça do animal. Usando o telescópio é importante porque permite que os eletrodos para ser stereotaxically posicionados com grande precisão.

3. Gravação eletrofisiológicos e coloração intracelular

  1. Faça uma pequena abertura na pia-máter e compensar o feedback capacitância de modo que quando o eletrodo toca o cérebro um sinal de realimentação é produzida. Isto permite a localização exata da superfície do cérebro.
  2. Produzir repetido deslocamento mandibular e avançar o eletrodo no cérebro com um motor de passo.
  3. Reconhecer impalements neuronal por quedas bruscas no potencial DC e identificar intrassomáticas impalements neuronal pela atividade sináptica em curso. Zumbindo o eletrodo com uma sobrecompensação dos capacitância ou tocando raramente produzem uma penetração celular de sucesso. Devido à alta impedância dos eletrodos, as respostas neuronal raramente são observados antes da penetração.
  4. Depois de empalar um neurônio ea penetração é considerado estável, caracterizar a resposta neuronal usando rampa e segurar e movimentos da mandíbula sinusoidal. 5 Mapa do campo receptivo do neurônio sondando a pele ao redor da cabeça e cavidade oral intra com uma sonda não-condutor como um palito de madeira. Se relevantes para o estudo, examinar a resposta do neurônio para outro funcionalmente estímulos relevantes, tais como a contração muscular e estímulos nocivos. Aferentes nociceptivos primários seis receptores neuronais responder a estímulos nociceptivos. Anesthesetics geral, tais como pentobarbital sódico não bloqueio da condução axonal em neurônios aferentes primários, mas sim diminuir a transmissão sináptica. Assim condução axonal no axônio aferente primário neuronal é preservada.
  5. Injetar corrente contínua (DC, 1-4NA) para um tempo de injeção total de 15 70nA minutos. Monitorar a penetração do eletrodo durante a injeção de corrente e interromper o potencial de membrana se torna mais positivo do que-30mV.

4. Processamento de tecidos

  1. Eutanásia do animal por overdose de pentobarbital (140mg/kg IV) e perfundir com um enxágüe vascular (0,9% NaCl 38 ° C, contendo 500 unidades de heparina e 1 ml de xilocaína 2% seguido de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) .
  2. Remover o cérebro e seção, em 50-100μm usando um vibratome em qualquer plano, frontal sagital ou horizontal. Secions são coletados livre flutuação em 25 ° C PBS.
  3. Processo do cérebro para DAB, incubando em soro de cabra normal e 1-2% 1% Triton X-100 em PBS 0,01 M seguido de incubação em avidina biotina (1:50 Elite Vectastain). Reagir seções usando níquel DAB com H 2 O 2. Ao processo de Texas Red, seções incubar no complexo avidina-biotina (1:50) em PBS overnight a 4 ° C e incubar em 4% Texas Red avidina DCS em PBST a 4 ° C durante a noite. Contracoloração seções com uma fluorescente Nissl mancha (NeuroTrace) 20min a 23 ° C.
  4. Se neurônio foi injetado com rodamina, visualize o neurônio injetado diretamente com um microscópio de fluorescência (Ex 545nm).

5. Combinando com o método de rotulagem retrógrada, imunocitoquímica, imagem confocal, análise quantitativa co-localização

O sucesso de combinar esta técnica com outros métodos, é em grande parte dependente de rotulagem intracelular bom.

  1. O método visualizadas aqui podem ser facilmente combinados com rotulagem neuronal retrógrada. 7-10 Para fazer isso, anestesiar o animal e utilizando uma técnica asséptica, injetar um traçador neuronal, tais como peroxidase (20% peroxidase. Sigma VI, Sigma) e 1% gérmen de trigo aggultinated peroxidase (Sigma) em regiões-alvo periféricos, tais como o músculo masseter. Este marcador neuronal será retomada em axônios periféricos e transportados através de transporte axonal ao somata motoneurônio. Para o músculo masseter, 15μl de traçador é injetado no músculo, utilizando uma micro microlitro estéril 10. Os animais são então colocados em uma almofada de aquecimento e monitorado até a recuperação anestésica e, em seguida, colocados em suas gaiolas para a recuperação. Após 24h, anestesiar animais e caracterizar fisiologicamente neurônios e intracelularmente manchá-las. Então perfundir o animal, como descrito acima e cortes de tecidos processo para a presença de HRP utilizando tetrametilbenzidina (TMB) como o Chromagen e tungstato de sódio como estabilizador e intensificou-se com cobalto. Seções lugar no tungstato de sódio a 1% dissolvida em 0,1 M PBS (pH 6,5) e TMB 0,0007% dissolvida em etanol absoluto e acetona a 15 ° C por 20 min. Então reagir cortes de tecidos, adicionando 1,0 ml de 0,3% H 2 O 2 por 100 ml de solução de incubação por 60 min. Enxaguar tecido em 0,1 M PBS (pH 6,5) e coloque em diaminobenzidina 0,05% (pH 7,4), cobalto 0,02% e 0,01% H 2 O 2 0,1 M em PBS (pH 7,4) por 10 min. a 37 ° C. Processo o tecido para a visualização do neurônio injetados com biotinamide como descrito e visualizar as relações entre o neurônio sensorial rotulados e uma variedade de motoneurônios.
  2. A técnica mostrada aqui também pode ser facilmente combinada com immnocytochemistry. 6 Como exemplo, immunocytochemically processo do cérebro para sinaptofisina para localizar com precisão as sinapses nos neurônios marcados (Fig. 3). Para fazer isso, incubar seções do cérebro do rato em anticorpos anti-sinaptofisina (1:10.000) para 2 dias a 4 ° C e incubar em anti-camundongo FITC (1:400) por 1h a 23 ° C.
  3. Neurônios marcados com marcadores fluorescentes ou processados ​​para imagens fluorescentes são ideais para imagens confocal. Figura 3 é um exemplo de uma secção óptica obtidos por microscopia confocal através de um bouton axônio. (Fig. 3). Gerar animações de neurônios rotuladas através da aquisição de várias secções ópticas através do neurônio rotulada (Fig. 4).
  4. Neurônios marcados com este método pode ser usado para a análise de co-localização quantitativa. Para fazer isso, use uma macro software disponíveis publicamente em conjunto com o NIH Imagem (encontrado em http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). Localize sinaptofisina dentro de terminais de axônio único, combinando rotulagem intracelular com imunocitoquímica sinaptofisina 6.

6. Resultados representativos:

Uma visão geral dos resultados representativos que podem ser obtidos através deste método são ilustrados na Figura 1. Este único neurônio do tronco cerebral foi eletrofisiologicamente registrados durante o movimento da mandíbula e, como pode ser visto claramente, a resposta deste neurônio (Figura 1 inferior esquerdo, azul claro) foi modulada durante o movimento. Este neurônio foi injetado com biotinamide após caracterização eletrofisiológica e posteriormente processadas para visualização. O neurônio reconstruído (Figura 1 médio, verde) pode ser realted de um marco anatômico, neste caso, o núcleo motor do trigêmeo designado (contorno vermelho). Com base na resposta neuronal durante o movimento ea reconstrução deste neurônio pode ser identificado como um neurônio secundário do fuso muscular aferentes. A figura 2 ilustra um exemplo representativo da resposta fisiológica de um neurônio durante o deslocamento da mandíbula. A resposta do neurônio é representado como frequência de disparo instantâneo. Note-se que a resposta neuronal imita o deslocamento mandibular, indicando que esse neurônio particular oferece feedback sensorial relacionado à posição mandibular. Figura 3 é uma imagem de alta ampliação de um axônio intracelularmente manchada combinado com coloração para sinaptofisina e uma mancha de Nissl. Observe a co-localização de sinaptofisina (amarelo) dentro da bouton axônio. Figura 4 é uma animação de um neurônio único, caracterizado fisiologicamente e intracelularmente rotulados.

Figura 1
A Figura 1. Visão geral do método. Superior esquerdo: deslocamento mandibular. Gravação Intracelular meio (verde) de único neurônio (amarelo). A morfologia deste neurônio foi reconstruída após a gravação intracelular e injeção. Contorno vermelho indica a localização do núcleo motor do trigêmeo. Canto inferior esquerdo: resposta fisiológica deste neurônio durante o movimento da mandíbula.

Figura 2
Figura 2. Resposta fisiológica Representante de um neurônio único músculo sensoriais gravadas in vivo durante o movimento da mandíbula. Observe a semelhança da resposta neuronal com deslocamento da mandíbula.

Figura 3
Figura 3. Terminal arborização axonal com boutons sináptica (inchaços vermelhos) de um neurônio sensorial intracelularmente manchada que responderam durante muscular sondagem. Processamento imunocitoquímicos subseqüentes para sinaptofisina mostra localização de sinaptofisina no bouton axonal (amarelo). Verde é uma mancha fluorescente Nissl.

Figura 4. Animation do músculo axônio neurônio fusiforme aferentes primários cuja resposta fisiológica foi gravado in vivo durante o movimento mandibular, o axônio foi então intracelularmente manchadas e processados ​​para visualização.
Download de um vídeo de alta resolução da Figura 4 aqui
Download de um vídeo de média resolução Figura 4 aqui

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Discussion

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O método ilustrado aqui é uma poderosa técnica que fornece informação importante sobre a função dos neurônios individuais e como a resposta de neurônios individuais contribui para circuitos neuronais. 9 Este conhecimento é fundamental para a compreensão da função sensório-motor. A maior força desta técnica é que permite a determinação é de um grande número de parâmetros sobre um neurônio, incluindo a fisiologia, a morfologia ea morfologia e distribuição sináptica. Quando combinado com outras técnicas, como informações de rotulagem retrógrada neuronal adicionais, tais como circuito neuronal pode ser caracterizada. 7,8 Outra vantagem deste método é que pode ser aprendida em etapas. Por exemplo, a gravação intracelulares podem ser realizados inicialmente, seguido de coloração intracelular com imunocitoquímica ou rotulagem neuronal retrógrada adicionado após o domínio do método inicial. Talvez a maior limitação da técnica é que somente um pequeno número de neurônios pode ser etiquetadas em qualquer experimento um. Tipicamente 2-3 neurônios de um determinado tipo fisiológico são inicialmente rotulado. Uma vez que a relação potencial entre a fisiologia e morfologia é formulado, experimentos adicionais são usados ​​para verificar cuidadosamente esta relação em experimentos em que apenas um único neurônio é rotulado.

O passo mais crucial para o sucesso deste método é a manutenção da estabilidade de gravação eletrofisiológicos intracelulares. Estabilidade de gravação irá variar muito, dependendo da localização dentro do cérebro do neurônio em estudo, mas uma série de manipulações podem ser usados ​​para aumentar a estabilidade de gravação. Um pneumotórax pode ser realizada e os animais ventilados artificialmente para reduzir as pulsações respiratórias. Estabilidade pode ser aumentada pela aplicação de uma pressão expiratória final positiva de cerca de 1 cm H 2 O. Quando a região de interesse dentro do cérebro é alcançado, a estabilidade pode ser melhorada pela hiperventilação do animal, diminuindo o volume respiratório e aumentar a freqüência respiratória. Alguns estudos eletrofisiológicos têm aplicado ágar quente sobre o cérebro e canulada a bexiga; esses procedimentos não têm sido eficazes no aumento da estabilidade de gravação neuronal no tronco cerebral. É importante ressaltar que os tempos de injeção não precisa ser longo. Bons resultados podem ser obtidos com tempos de injeção de cerca de 5 minutos. Devido ao tamanho da ponta pequena do microeletrodos, quebra do eletrodo dentro do cérebro normalmente não produz uma grande liberação de traçador. Portanto, o eletrodo pode ser substituído e neurônios com sucesso gravado e coradas até várias centenas de micrômetros da localização da ruptura do eletrodo. Se o eletrodo está entupido ou a solução de gravação não enche a ponta do eletrodo de forma adequada, o ruído será muito maior eo eletrodo deve ser substituído. Teste de impedância do eletrodo antes da inserção no cérebro reduz intervalos eletrodo improdutivas e economiza tempo. Se você está tentando gravar a partir de uma pequena região do posicionamento estereotáxica cerebral é fundamental. Eu uso um telescópio anexado à mesa de gravação para manter um zero fixo estereotáxica. O telescópio é muito útil porque o eletrodo pode ser colocado no suporte do eletrodo conectado à mesa de gravação e, em seguida, visto sob a ampliação. Isto permite a colocação muito precisa do microeletrodo e zeragem de eletrodos de substituição.

Uma série de estudos recentes têm usado rotulagem neuronal juxtacellular 11,12. Com este método um eletrodo é colocado na proximidade de um neurônio com base nas características da gravação neuronal e um traçador neuronal é ejetado. Um problema óbvio potencial com este método é a rotulagem falsa desde traçador pode ser incorporada no dendritos e axônios de outros neurônios na vizinhança do eletrodo. Além disso, as relações de entrada-saída do neurônio não pode ser determinado porque os potenciais de ação registrados extracelularmente pode ser gerado não só pela entrada sináptica para o neurônio, mas por propriedades intrínsecas do neurônio. Com o método aqui relatados, os neurônios são rotulados apenas enquanto o microeletrodo é realmente dentro do neurônio e, portanto, não há ambiguidade quanto à atribuição da atividade neuronal para o neurônio manchado. Isto é particularmente importante quando rotulagem axônios porque o movimento do microeletrodo por alguns resultados microns espúria na rotulagem. Além disso, eventos subliminares, incluindo potenciais sinápticos podem ser gravados a partir do neurônio empalado.

Estudos futuros poderão combinar este método com movimentos evocados. Por exemplo, a estimulação cortical pode evocar movimentos mastigatórios e da estabilidade de gravação dentro do tronco deve permitir a gravação e coloração intracelular de neurônios durante estes movimentos evocados. Uma vez que esta técnica pode ser feita com intervenção cirúrgica mínima, também pode ser possvel para usar este método para injetar substâncias que alteram a expressão gênica in vivo.

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Disclosures

Experimentos em animais foram realizados de acordo com o guidlines e regulação estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 86-23, revisado em 1985) e da Universidade de Maryland Animal Care e Use Comitê.

Acknowledgments

Agradeço Anthony Taylor para a formação inicial em gravação no intracelular vivo e A Maxwell e David Brown para ajudar com o desenvolvimento inicial da técnica de coloração intracelular. Agradeço M. Prata ajuda com a macro collocalization. Muitos estudiosos com quem tenho colaborado desde insight para o desenvolvimento desta técnica, incluindo R. Donga, Moritani M., P. Luo, Ambalavanar R.. Esta técnica foi desenvolvida com o apoio considerável de NIH concede DE10132, DE15386 e RR017971.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
electromagnetic vibrator Ling Dynamic Systems V101
signal generator Feedback Systems PFG605 capable of producing trapezoidal output signal
electrode glass Sutter Instrument Co. AF100-68-10 with filament
electrode puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 or P-80
biotinamide Vector Laboratories SP-1120 stored at 4°C
Texas Red avidin DCS Vector Laboratories A-2016
tetramethlyrhodamine Molecular Probes, Life Technologies D-3308 3000 molecular weight, lysine fixable
mouse anti-synaptophysin antibody Chemicon International MAB5258
fluorescent Nissl stain Neurotrace, Life Technologies N-21480
electrode tester Winston Electronics BL-1000-B to measure electrode impedance
electrometer Axon Instruments Axoprobe 1A, Axoclamp 2B

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References

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Dessem, D. Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement. J. Vis. Exp. (50), e2650, doi:10.3791/2650 (2011).More

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