Summary
En teknik beskrivs att kvantifiera in vivo fysiologiska svar av däggdjurs nervceller under rörelse och korrelera fysiologi av neuron med neuronal morfologi, neurokemiska fenotyp och synaptic microcircuitry.
Abstract
Den roll som enskilda nervceller och deras funktion i neuronala kretsar är grundläggande för att förstå neuronala mekanismer av sensoriska och motoriska funktioner. De flesta undersökningar av sensomotoriska mekanismer lita på någon undersökning av nervceller, medan ett djur är statiskt 1,2 eller spela extracellulära nervaktivitet under en rörelse. 3,4 Även om dessa studier har gett viktigt underlag för sensomotorisk funktion, de antingen inte utvärdera funktionell information som uppstår under en rörelse eller är begränsade i sin förmåga att till fullo karakterisera anatomi, fysiologi och neurokemiska fenotyp av neuron. En teknik visas här som gör en omfattande karakterisering av enskilda nervceller under en in vivo-rörelse. Denna teknik kan användas inte bara för att studera primära afferenta nervceller, men också för att karakterisera motoneurons och sensomotoriska interneuronen. Ursprungligen svaret av en enda neuron är inspelad med elektrofysiologiska metoder vid olika förflyttningar av underkäken följt av bestämning av receptiva fält för neuron. En neuronala spårämne är sedan intracellulärt injiceras i neuron och hjärnan behandlas så att neuron kan visualiseras med ljus, elektron eller konfokalmikroskopiska (Fig. 1). Den detaljerade morfologi kännetecknas neuron är sedan rekonstrueras så att neuronala morfologi kan korreleras med den fysiologiska respons av neuron (bild 2,3). I detta meddelande viktiga viktiga detaljer och tips för ett framgångsrikt genomförande av denna teknik finns. Värdefull ytterligare information kan bestämmas för de neuron som studeras genom att kombinera denna metod med andra tekniker. Retrograd neuronala märkning kan användas för att bestämma nervceller som är märkt neuron synapser, vilket möjliggör detaljerad bestämning av neuronala kretsar. Immuncytokemi kan kombineras med denna metod för att undersöka signalsubstanser i märkt neuron och bestämma den kemiska fenotyper av nervceller som den märkta neuron synapser. Den märkta neuron kan också behandlas för elektronmikroskop för att bestämma ultrastrukturella funktioner och microcircuitry av den märkta neuron. Sammantaget denna teknik är en kraftfull metod för att grundligt karaktärisera nervceller under in vivo rörelse vilket gör att betydande insikt i den roll som neuron i sensorimotor funktion.
Protocol
1. Animal Förberedelser
- Bedöva råtta med natrium pentobarbital (50mg/kg IP) och lägg på en värmedyna. Raka huden överliggande bakre skallen med djur Clippers. Kontrollera djuret för att säkerställa att en kirurgisk nivå av nivån av anestesi har erhållits genom testning för avsaknaden av ett tillbakadragande reflex och läte när tårna kläms liksom avsaknaden av en ögonlocksreflexer. Kontrollera nivån av anestesi var 15 minut och upprätthålla en kirurgisk nivå anesthetisa genom injektioner av natrium pentobarbital 15mg/kg var 45 minuter.
- Använd aseptisk teknik och gör ett snitt i ljumsk området strax distalt om vecket som bildas av buken och låret och sätta in en kanyl (1 mm diameter, Clay Adams) i lårbenshals ven, och lårbensartären. Gör en mittlinjen snitt i submandibular regionen, återspeglar infrahyoid muskler. Gör ett litet snitt i luftstrupen och för in en kanyl (2mm diameter) för att tillåta ventilation. Tye en sutur runt trachael cannual att säkra det på place.Monitor systemisk diastoliskt och systoliskt blodtryck via arteriella kanylen. Förutom att övervaka tillbakadragandet och ögonlocksreflexer nu blodtrycksmätaren för att bedöma graden av anestesi. Administrera ytterligare bedövning när det behövs via venös kanyl.
- Placera råttan i en stereotaxic ram och utföra en kraniotomi att exponera lillhjärnan. Fäst tracheal kanyl till en gnagare respirator. Ventilera djuret med en volym på 2 cm 3 i en takt på 100/min med fuktad luft. Ett positivt slut expiratory tryck på 1 cm H 2 O bör bibehållas för att förhindra att lungorna kollapsar. Var 15 minuter hyperinflate lungorna för att förhindra atelektas. Täck sedan ytan av hjärnan med uppvärmd mineralolja (30 ° C). Var noga med att undvika den stora venösa sinus belägna direkt under korsningen mellan parietala och ben interparietal.
- Applicera cyanoakrylat lim till en stav kopplad till en elektromagnetisk vibrator och fäst stången i diastema i käken. Flytta underkäken med hjälp av styrsignaler till vibrator från antingen en A / D-utdata från datorn eller en signalgenerator.
- Placera en siliver-silver elektrod klorid jordning under huden intill kraniotomi.
2. Elektrod förberedelse
- Tillverka microelectrodes från kvarts eller aluminiumsilikat glaset med en horisontell mikroelektrod avdragare.
- Fyll mikroelektrod med 5-10% biotinamide upplöst i 0,25 m KCl och 0,5 M Tris HCl-buffert (pH 7,6) eller 2% tetramethlyrhodamine i koksaltlösning (pH 6). Kontrollera elektrod impedans med en elektrod testare. Att spela in från med stor diameter axoner göra elektroder med en impedans på 60-80m Ω, för små axoner och interneuronen göra elektroder med impedansen 80-150MΩ.
- Placera mikroelektrod in i huvudet skede av elektrometern. Visualisera elektroden genom ett litet teleskop (20X med en komplett riktmedel) som är fixerad i position bakom djurets huvud. Med hjälp av teleskopet är viktigt eftersom det gör att elektroderna ska stereotaxically placeras med stor precision.
3. Elektrofysiologiska inspelning och intracellulär färgning
- Gör en liten öppning i pia mater och överkompenserar kapacitans återkoppling så att när elektroden rör hjärnan en återkopplingssignal produceras. Detta möjliggör exakt placering av ytan av hjärnan.
- Producera upprepade mandibular förskjutning och föra elektroden i hjärnan med en stegmotor.
- Erkänn neuronala impalements av plötsliga droppar i DC-potential och identifiera intrasomatic neuronala impalements av pågående synaptisk aktivitet. Surrande elektroden med överkompensation av kapacitans eller knacka sällan producera en framgångsrik cellpenetration. På grund av den höga impedans av elektroderna är neuronala svar sällan observeras innan penetration.
- När du spetsa en neuron och penetration bedöms stabilt, karakterisera neuronala svaret med hjälp av ramp och hålla och sinusformade käken rörelse. 5 Map den receptiva fält av neuron genom att sondera huden runt huvudet och inom munhålan med en icke-ledande sond t.ex. en träpinne. Om relevanta för studien, undersöka svar av neuron till andra funktionellt relevanta stimuli som muskelsammandragning och skadliga stimuli. 6 Primär afferenta nociceptiva neuronala receptorer svarar på nociceptiva stimuli. Allmänna anesthesetics såsom natrium pentobarbital inte blockera axonal överledningen i primär afferenta nervceller utan snarare pressa synaptisk överföring. Således axonal överledning i den primära afferenta neuronala Axon bevaras.
- Injicera likström (DC, 1-4NA) för en total injektion på 15-70nA minuter. Övervaka elektrod penetration under pågående injektion och avbryta om membranpotential blir mer positiva än 30mV.
4. Tissue bearbetning
- Euthanize djuret genom överdos av pentobarbital (140mg/kg IV) och BEGJUTA med en vaskulär skölj (0,9% NaCl 38 ° C som innehåller 500 enheter heparin och 1 ml 2% Xylocain följt av 4% paraformaldehyd i 0,1 miljoner fosfatbuffert (pH 7,4) .
- Ta bort hjärnan och avsnitt den på 50-100μm med en vibratome i antingen framifrån, sagittal eller horisontalplanet. Secions samlas fritt flytande i 25 ° C PBS.
- Process hjärnan för DAB genom inkubering i 1-2% normal get serum och 1% Triton X-100 i 0.01M PBS följt av inkubering i avidin biotin komplex (01:50 Elite Vectastain). Reagera sektioner med hjälp av nickel-DAB med H 2 O 2. För att processen för Texas Red, inkubera avsnitt i avidin-biotin komplex (1:50) i PBS över natten vid 4 ° C och sedan Inkubera i 4% Texas Red avidin DCS i PBST vid 4 ° C över natten. Motfärga sektioner med ett fluorescerande Nissl fläck (NeuroTrace) 20min vid 23 ° C.
- Om neuron injicerades med Rhodamine, visualisera den injicerade neuron direkt med ett fluorescerande mikroskop (Ex 545nm).
5. Kombinera metoden med retrograd märkning, immuncytokemi, konfokal avbildning, kvantitativ colocalization analys
Framgången med att kombinera denna teknik med andra metoder är i hög grad beroende av god intracellulära märkning.
- Metoden visualiseras här kan enkelt kombineras med bakåtsträvande neuronala märkning. 7-10 För att göra detta, söva djuret och med aseptisk teknik, injicera en neuronal spårämne som pepparrotsperoxidas (20% pepparrotsperoxidas. Sigma VI, Sigma) och 1% vete-groddar aggultinated pepparrotsperoxidas (Sigma) i perifera mål regioner som tuggmuskel. Detta neuronala spårämnet kommer att tas upp i perifera axoner och transporteras via axonal transport till motoneuron somata. För tuggmuskel är 15μl av spårämne injiceras i en muskel med en steril 10 mikroliter mikrosprutan. Djuren placeras sedan på en värmedyna och övervakas tills återhämtat sig från anestesi och sedan placeras i sina burar för återhämtning. Efter 24h, bedöva djur och fysiologiskt karakterisera nervceller och intracellulärt fläcken dem. Sedan BEGJUTA det djur som beskrivs ovan och process sektioner vävnad för förekomst av HRP med tetrametylbensidin (TMB) som chromagen och natrium tungstate som stabilisator och intensifieras med kobolt. Placera avsnitt i 1% natrium tungstate upplöst i 0,1 miljoner PBS (pH 6,5) och 0,0007% TMB upplöst i absolut etanol och aceton vid 15 ° C i 20 minuter. Då reagerar vävnadssnitt genom att tillsätta 1,0 ml 0,3% H 2 O 2 per 100 ml inkubation lösning för 60 min. Skölj vävnad i 0,1 miljoner PBS (pH 6,5) och placera i 0,05% Diaminobenzidin (pH 7,4), 0,02% kobolt och 0,01% H 2 O 2 i 0,1 miljoner PBS (pH 7,4) i 10 min. vid 37 ° C. Process vävnaden för visualisering av neuron injicerats med biotinamide som beskrivs och visualisera förhållandet mellan den märkta sensoriska neuron och en mängd olika motoneurons.
- Tekniken visas här kan också lätt kombineras med immnocytochemistry. Som ett exempel immunocytochemically process hjärnan för synaptophysin att exakt lokalisera synapser inom märkta nervceller (Fig. 3) 6. För att göra detta, inkubera hjärnan avsnitt i mus-anti-synaptophysin antikropp (1:10,000) under 2 dagar vid 4 ° C och sedan inkubera i anti-mus-FITC (1:400) för 1 timme vid 23 ° C.
- Nervceller märkta med fluorescerande markörer eller behandlas för fluorescerande avbildning är idealiska för konfokal avbildning. Figur 3 är ett exempel på en optisk del som erhållits med konfokalmikroskopi genom en Axon Bouton. (Fig. 3). Skapa animeringar av märkta nervceller genom att förvärva flera optiska delar genom den märkta neuron (bild 4).
- Nervceller märkta med denna metod kan användas för kvantitativa colocalization analys. För att göra detta använder en allmänt tillgänglig programvara makro i samband med NIH Image (finns på http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). Lokalisera synaptophysin inom samma axon terminaler genom att kombinera intracellulära märkning med synaptophysin immuncytokemi 6.
6. Representativa resultat:
En översikt över de representativa resultat som kan uppnås med denna metod illustreras i figur 1. Denna enda hjärnstammens neuron elektrofysiologiskt spelades in under rörelse av underkäken, och som tydligt kan ses, var svaret i denna neuron (figur 1 nere till vänster, ljusblått) modulerat under förflyttning. Detta neuron injicerades med biotinamide efter elektrofysiologiska karakterisering och därefter behandlas för visualisering. Den rekonstruerade neuron (figur 1 mitten, grön) kan vara riktigaTed till en anatomiska landmärke, i det här fallet trigeminala motorn kärnan utsedd (röd kontur). Baserat på det neuronala svaret under rörelse och återuppbyggnad detta neuron kan identifieras som en sekundär muskelspolesystemet afferenta neuron. Figur 2 visar ett representativt exempel på fysiologiska svar på en neuron under käke fördrivning. Svaret av neuron representeras som momentan avfyrningsfrekvens. Observera att det neuronala svaret nära efterliknar mandibular förskjutning som visar att just denna nervcell ger sensorisk återkoppling relaterade till mandibular position. Figur 3 är en hög förstoring bild av ett intracellulärt färgade axon kombinerat med färgning för synaptophysin och en Nissl fläck. Notera colocalization av synaptophysin (gul) i axonet Bouton. Figur 4 är en animation av en enda, fysiologiskt karaktäriseras och intracellulärt märkt neuron.
Figur 1. Översikt över metoden. Övre vänster: mandibular förskjutning. Mellanöstern Intracellulär inspelning (grön) från enstaka neuron (gul). Morfologi av neuron rekonstruerades efter intracellulära inspelning och injektion. Röd kontur visar placeringen av trigeminus motorn kärnan. Nedre vänster: fysiologisk reaktion av detta neuron under käken rörelse.
Figur 2. Representant fysiologiska svar på en enda muskel sensoriska neuron registrerats in vivo vid förflyttning av underkäken. Notera likheten mellan de neuronala svar med käken deplacement.
Figur 3. Terminal axonal arborization med synaptiska boutons (röda svullnader) av ett intracellulärt färgade sensoriska neuron som svarade under muskeln sondering. Efterföljande immuncytokemiska behandling för synaptophysin visar lokalisering av synaptophysin inom axonal Bouton (gul). Green är en fluorescerande Nissl fläck.
Figur 4. Animering av muskelspolesystemet primära afferenta neuron axonet vilkas fysiologiska svar spelades in vivo under mandibular rörelsen var axonet sedan intracellulärt färgas och behandlas för visualisering.
Ladda ner en högupplöst video av Figur 4 här
Ladda ner en medelhög upplösning av Figur 4 här
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden illustreras här är en kraftfull teknik som ger viktig information om den funktionen av enskilda nervceller och hur svaret från enskilda nervceller bidrar till neuronala kretsar. 9 Denna kunskap är grundläggande för att förstå sensomotoriska funktionen. Den största styrkan med denna teknik är att det möjliggör fastställandet av ett stort antal parametrar om en neuron, inklusive fysiologi, morfologi och synaptic morfologi och distribution. I kombination med andra tekniker som bakåtsträvande neuronala märkning ytterligare information såsom neuronala kretsar kan karakteriseras. 7,8 annan fördel med denna metod är att det kan vara lärt sig i steg. Till exempel kan intracellulära inspelning inledningsvis utföras, följt av intracellulär färgning med immuncytokemi eller bakåtsträvande neuronala märkning läggas till efter behärskning av den ursprungliga metoden. Den kanske största begränsningen av tekniken är att endast ett litet antal nervceller kan märkas i något experiment. Normalt två till tre neuroner av en viss fysiologisk typ är initialt märkta. När potentiella förhållandet mellan fysiologi och morfologi är formulerat, är ytterligare experiment används för att noggrant kontrollera detta förhållande i experiment där bara en enda neuron är märkt.
Det mest avgörande steget för att lyckas med denna metod är att upprätthålla elektrofysiologiska intracellulär inspelning stabilitet. Inspelning stabilitet kommer att variera kraftigt beroende på var i hjärnan av neuron som studeras, men ett antal manipulationer kan användas för att öka inspelning stabilitet. En pneumotorax kan utföras och djuret artificiellt ventilerade för att minska respiratoriska pulseringar. Stabilitet kan ökas ytterligare genom att tillämpa en positiv utgång expiratory tryck på ca 1 cm H 2 O. När regionen av intresse i hjärnan nås, kan stabiliteten ökas genom hyperventilerar djuret genom att minska respiratoriska volym och ökad andningsfrekvens. Vissa elektrofysiologiska studier har tillämpats varma agar över hjärnan och kanylerade urinblåsan, och förfarandena har inte varit effektiva i att öka neuronala inspelning stabilitet i hjärnstammen. Det är viktigt att påpeka att injektion gånger inte behöver vara lång. Goda resultat kan uppnås med injektion gånger på ca 5 minuter. På grund av den lilla spetsen storlek microelectrodes, brott på elektroden i hjärnan vanligtvis inte ger ett stort utsläpp av spårämnet. Därför elektroden kan ersättas och nervceller framgångsrikt registreras och färgas inom flera hundra mikrometer av var elektroden går sönder. Om elektroden är igensatt eller inspelningen lösningen fyller inte ut spetsen på elektroden tillräckligt, kommer buller ökas och elektroden bör bytas ut. Testa elektrodimpedans innan de sätts in i hjärnan minskar kraftigt improduktiva elektrod traktater och sparar tid. Om du försöker spela in från en liten region av hjärnan stereotaxic positionering är av yttersta vikt. Jag använder ett teleskop knutna till inspelningen bordet för att upprätthålla ett fast stereotaxic noll. Teleskopet är mycket användbart eftersom elektroden kan placeras in i elektrodhållaren knutna till inspelningen bordet och sedan ses under förstoring. Detta möjliggör mycket noggrann placering av mikroelektrod och nollställning av ersättning elektroder.
En rad färska studier har använt juxtacellular neuronal märkning. 11,12 Med denna metod en elektrod placeras i närheten av en neuron baserat på egenskaper hos neuronala inspelningen och en neuronal spårämne matas ut. En självklar potentiellt problem med denna metod är falska märkning eftersom spårämne kan införlivas i dendriter och axoner andra nervceller i närheten av elektroden. Dessutom kan input-output-relationer av neuron inte bestämmas på grund extracellularly inspelade aktionspotentialer kan genereras inte bara genom synaptisk input till neuron utan genom inneboende egenskaper av neuron. Med den metod som redovisas här är nervceller bara märks när mikroelektrod faktiskt i neuron och därför finns det ingen tvetydighet om tilldelning av nervaktivitet till färgade neuron. Detta är särskilt viktigt när märkningen axoner eftersom rörelse mikroelektrod med några mikrometer resulterar i falsk märkning. Dessutom kan subthreshold händelser inklusive synaptiska potentialer spelas in från spetsade neuron.
Framtida studier skulle kunna kombinera denna metod med framkallat rörelser. Till exempel kortikal stimulering kan framkalla Tuggmuskel rörelser och inspelningen stabiliteten inom hjärnstammen bör tillåta intracellulära inspelning och färgning av nervceller under dessa framkallat rörelser. Eftersom denna teknik kan ske med minimal kirurgiska ingrepp, kan det också vara Posssvårantändliga för att använda denna metod för att injicera ämnen som förändrar genuttryck in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med guidlines och reglering som anges i Guide för skötsel och användning av försöksdjur (NIH publikation nr 86-23, reviderad 1985) och University of Maryland Djurvård och användning kommittén.
Acknowledgments
Jag tackar Anthony Taylor för inledande utbildning i in vivo intracellulära inspelning och en brun och David Maxwell för hjälp med den inledande utvecklingen av den intracellulära målningsteknik. Jag tackar M. Silver för hjälp med collocalization makro. Många forskare som jag har samarbetat gav en inblick i utvecklingen av denna teknik, inklusive R. Donga, M. Moritani, P. Luo, R. Ambalavanar. Denna teknik har utvecklats med ett betydande stöd från NIH bidrag DE10132, DE15386 och RR017971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
- Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task. J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).
- Frigon, A., Gossard, J. Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord. J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).
- Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching. J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).
- Ma, C., He, J. A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys. J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).
- Dessem, D., Donga, R., Luo, P. Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions. J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).
- Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).
- Luo, P., Dessem, D. Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular. J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).
- Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).
- Luo, P., Wong, R., Dessem, D. Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide. J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).
- Luo, P., Dessem, D. Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat. J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).
- Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep. Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).
- Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum. Neuroscience. 168, 395-404 (2010).
