Summary
描述量化哺乳动物在运动神经元在体内的生理反应和相关的神经元与神经元的形态，神经化学表型和突触的微型电路的生理的一种技术。
Abstract
的单个神经元和神经回路的功能的作用是基本的了解感觉和运动功能神经元的机制。大多数的感觉机制调查依赖于任何的神经元的考试，而动物是静态1,2或在运动的记录外神经元的活动。3,4，虽然这些研究提供了感觉功能的基本背景，他们要么不评价功能的信息发生在运动或在他们的神经解剖学，生理学和神经化学物质的表型的能力，充分体现有限。这里显示的一种技术，它允许在单个神经元在体内的运动广泛的特性。可以使用这种技术，不仅要研究初级传入神经元，但也表征运动神经元和感觉interneurons。最初的单个神经元的响应是使用在其次为神经元的感受野的决心下颌骨的各种动作电生理方法记录。神经示踪细胞内注入的神经和大脑的处理，使神经元可与可视光，电或激光共聚焦显微镜（图1）。详细的形态特征的神经元，然后重建，使神经元的形态可与相关的生理反应的神经元（图2,3）。在这种沟通，提供重要的关键细节，这项技术的成功实施的提示。在研究神经元与其他技术相结合，这种方法可确定有价值的额外信息。逆行神经标签可用于确定神经细胞标记的神经元突触，从而使神经回路的详细决心。这种方法可以结合免疫组织化学内标记神经元的神经递质研究，并确定与该标记的神经元突触神经元的化学表型。标记的神经元也可以处理电子显微镜确定超微结构特征和标记神经元的微型电路。总体来说，这一技术是一种强大的方法来深入刻画在神经元在体内的运动，从而使大量洞察到感觉功能的神经元的作用。
Protocol
1。动物的制备
- 麻醉大鼠用戊巴比妥钠（50mg/kg的IP）和加热垫的地方。剃须皮肤覆动物快船队的后头骨。检查动物，以保证手术的麻醉水平，已撤回反射和发声的情况下获得通过测试时脚趾捏了眼睑的反射的情况下，作为。检查每15分钟的麻醉水平，并保持了anesthetisa注射戊巴比妥钠按15mg/kg，每45分钟的手术水平。
- 使用无菌技术操作，使切口在腹股沟区的远端所形成的腹部和大腿内侧的折痕，然后插入到股静脉导管（直径为1mm，粘土亚当斯）和股动脉。请在颌下区的正中切口，反映舌骨肌肉。在气管的一个小切口插入导管（直径2mm），让空气流通。泰伊缝合cannual place.Monitor通过动脉插管全身的舒张压和收缩压血压，以确保它周围的trachael。现在除了监测撤离和眼睑的反射监测血压，以评估麻醉水平。需要通过静脉插管时，执行额外的麻醉。
- 大鼠放入一个立体框架，进行开颅手术暴露小脑。将气管插管啮齿类动物呼吸机。通风量在加湿空气的100/min率与2厘米3的动物。应该保持一个积极的结束，1厘米的H 2 O呼气压力，以防止肺萎陷。每隔15分钟hyperinflate肺部，以防止肺不张。然后盖上温暖的矿物油（30℃）的大脑表面。要小心，以避免直接下顶叶和interparietal骨骼之间的交界处，位于大静脉窦。
- 氰基丙烯酸酯胶，再加上电磁振动器一杆，杆附着在颚纵裂。振动器移动下颌骨的使用命令信号从一个A / D转换的计算机输出或信号发生器。
- 开颅附近的皮肤下放置一个siliver氯化银接地电极。
2。电极的制备
- 制造石英或铝硅酸盐玻璃的微电极，使用水平电极拉马。
- 填充5-10％溶解于0.25米的三KCl和0.5M HCl缓冲液（pH值7.6）或2％的盐水tetramethlyrhodamine（pH值6）biotinamide微电极。检查电极测试仪电极阻抗。要记录从大直径的轴突，使电极与一个60 - 80MΩ的阻抗，小轴突和interneurons使电极阻抗为80 -150MΩ。
- 微电极放入头阶段的静电。可视化，通过一个小望远镜（20X与一个封闭的十字线），这是动物的头后面的位置固定在电极。使用的望远镜是非常重要的，因为它允许对电极stereotaxically定位非常精确。
3。电生理记录和细胞内染色
- 在软脑膜小开放和过度的电容反馈，使电极接触时大脑产生一个反馈信号。这使得大脑表面的准确位置。
- 产生反复下颌位移和提前进入大脑的电极与步进电机。
- 神经impalements承认直流潜在的突然下降和确定intrasomatic神经元突触活动正在进行impalements。嗡嗡过度补偿电容的电极或窃听很少产生一个成功的细胞渗透。由于高阻抗电极，神经元的反应很少观察到渗透前。
- 之后刺穿一个神经细胞，被认为是稳定的渗透，使用的坡道和举行正弦下颌运动特征的神经元的反应，通过探测与非导电探针头部周围的皮肤和口腔内的5地图的神经元的感受野如木棍。如果有关的研究，研究神经元的其他功能，如肌肉收缩和有害刺激的相关刺激的反应，6初级传入痛觉的神经受体伤害性刺激作出反应。如戊巴比妥钠的anesthesetics不阻止在初级传入神经元轴突传导而抑制突触传递。因此，在初级传入的神经元轴突轴突传导被保存下来。
- 电流注入（DC，1 4nA）共注射时间为15 70nA分钟。显示器在电流注入电极的渗透和停止，如果比- 30mV的膜电位变得更加积极。
4。组织处理
- 安乐死的动物过量苯巴比妥（140mg/kg四）和灌注血管冲洗（0.9％氯化钠38 ° C含肝素500个单位和1毫升2％xylocaine 4％多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲液（pH值7.4） 。
- 删除在50 -100μm的大脑和部分它使用一个vibratome在额叶，矢状面或水平面。 Secions收集，PBS在25℃彗星自由浮动。
- 民建联大脑的过程培育1-2％正常山羊血清和1％的Triton X - 100在0.01M PBS，随后在抗生物素蛋白生物素复合潜伏期（1:50精英Vectastain）。使用镍，民建联与H 2 O 2反应部分。为了处理得克萨斯红，生物素 - 亲和素复合物在PBS（1:50）4℃过夜孵育部分° C，然后在4％得克萨斯红抗生物素蛋白DCS在PBST孵育4℃过夜。染液一个荧光的尼氏染色（NeuroTrace）20分钟23 ° C节
- 如果神经元与罗丹明注入，可视化注入神经元直接用荧光显微镜（前545nm）。
5。逆行标签，免疫细胞化学，共聚焦成像，定量的共定位分析相结合的方法
这种技术与其他方法结合起来的成功在很大程度上取决于良好的细胞内的标签。
- 在这里可以很容易地结合逆行神经标记方法可视化 7-10要做到这一点，麻醉动物和使用无菌技术，注入辣根过氧化物酶（20％的辣根过氧化物酶，西格玛西格玛六）如神经示踪和1％小麦胚芽aggultinated到周边的目标区域，如咬肌的辣根过氧化物酶（Sigma公司）。这种神经细胞示踪将采取到周边的轴突和运动神经元somata通过轴突运输运输。对于咬肌，示踪15μl注入使用无菌的10微升microsyringe肌肉。动物，然后放置在加热垫和监测，直到恢复从麻醉，然后放置在他们的笼子里进行恢复。 24小时后，麻醉动物和生理特征的神经元和细胞内染色。然后灌注所述以上的HRP使用四甲基联苯胺（TMB）作为chromagen和钨酸钠作为稳定和加强与钴的存在和过程组织切片的动物。放置节在1％的钠钨溶解于0.1M PBS（pH值6.5）和0.0007％TMB无水乙醇和丙酮中溶解，在15 ° C下20分钟。然后加入1.0毫升的0.3％H 2 O 2％的潜伏期为60分钟的解决方案100毫升反应的组织切片。二氨基联苯胺（pH值7.4），0.05％，0.02％钴，和0.01％的H 2 O 2 0.1M PBS液（pH 7.4）10分钟，冲洗0.1M PBS（pH值6.5）的组织和地点。在37 ° C biotinamide注入所述的神经元的可视化过程中的组织和感觉神经元和运动神经元的各种标记之间的关系可视化。
- 这里显示的技术也可以很容易地结合与immnocytochemistry 6作为一个例子，免疫细胞化学过程中的突触脑准确定位标记的神经元突触内（ 图3）。要做到这一点，孵化脑切片，鼠抗突触素抗体（1:10,000）2天在4 ° C，然后在抗鼠FITC（1:400）孵育23小时° C。
- 与荧光标记物标记或荧光成像处理的神经元共焦成像的理想选择。图3是共聚焦显微镜获得通过轴突布顿光学节的一个例子。 （ 图3）。标记神经元的动画生成多个光学部分获得通过标记的神经元（ 图 4 ）。
- 用这种方法标记神经元可用于定量共定位分析。要做到这一点，在与美国国立卫生研究院图像使用公开可用的软件宏（http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm中）。本地化在单一的轴突终端突触相结合，与突触素免疫细胞化学细胞内的标签。
6。代表性的成果：
可以用这个方法取得的代表性成果的概述如图 1所示。这种单一的脑干神经元electrophysiologically记录下颌骨运动期间，由于可以清楚地看出，这个神经元的反应（图 1左下角，淡蓝色）调制在运动过程中。这个神经元是注射后的电生理特性biotinamide和随后进行可视化处理。重建后的神经元（图1的中间，绿色）可以实时特德解剖标志，在这种情况下指定的三叉神经运动核（红色轮廓）。基于运动和重建过程中的神经元的反应神经元可以被认定为次要肌梭传入神经 元，图2展示了一个有代表性的例子下颚位移过程中神经元的生理反应。代表的神经元的反应是瞬时的发射频率。请注意神经元的反应密切模仿下颌表明这个特定的神经元提供感官反馈有关下颌位置的位移。图3是一个高放大倍率的图像，结合染色突触和一个尼氏染色的细胞染色轴突。注意突触（黄色）的轴突布顿内共定位。 图4是一个单一的，生理特点和神经元细胞标记的动画。
图1概述的方法。左上：下颌位移。从单一的神经元（黄色）中的细胞内记录（绿色）。这种神经元的形态，细胞内记录和注射后重建。红色轮廓显示三叉神经运动核的位置。左下：在下颌运动，这种神经元的生理响应。
图2代表一个单一的肌肉感觉记录下颌骨的运动过程中的神经元在体内的生理反应。注意下颚位移的神经反应的相似性。
图3。终端与一个细胞内染色在肌肉探测回应的感觉神经元突触boutons（红色肿胀）轴突分枝。随后突触的免疫处理，显示了突触内的轴突布顿（黄色）的本地化。绿色是一种荧光尼氏染色。
图4。肌梭初级传入神经 元轴突的生理反应记录下颌运动期间体内的动画，轴突然后被细胞内染色和可视化处理。
图4的高清晰度视频
图4的中等分辨率视频
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Discussion
这里说明该方法是一个强大的技术到单个神经元的功能提供重要的启示，以及如何对单个神经元的反应， 有助于神经回路。9这方面的知识，了解感觉功能的根本。这项技术最大的优势就是允许了大量有关的一个包括生理，形态和突触的形态和分布的神经元参数的决心。当与其他技术，如逆行神经标记的其他信息，如神经回路相结合的特点 。7,8这种方法的另一个优点是它可以了解到在步骤。例如，可以进行初步细胞内记录，其次是与细胞内免疫细胞化学法或逆行神经元增加标签后的最初方法的掌握染色。也许，该技术的最大的限制是，只有少数的神经元，可以在任何一个实验标记。通常两到三年的一个特殊的生理类型的神经元最初的标签。一旦生理和形态之间的潜在关系制定的，另外的实验中使用，要仔细检查这一实验，其中只有一个单一的神经元被标记的关系。
这种方法的成功，最关键的一步是保持细胞内电生理记录稳定。录制的稳定取决于正在研究大脑的神经元内的位置，但一个操作数可以被用来增加录制稳定后会相差很大。可以进行气胸和动物的人工通风，以减少呼吸脉动。稳定性，可申请一个1厘米左右的H 2 O呼气末正压压力进一步增加当达到利益的大脑区域内，稳定，可增强hyperventilating动物减少呼吸量，增加呼吸频率。一些电生理研究已应用在大脑温暖琼脂和空心膀胱;这些程序没有得到有效地增加脑干神经元记录稳定。重要的是要指出，注射时间并不需要很长。注射时间约5分钟可以得到良好的效果。由于小针尖大小的微电极，大脑内的电极断裂通常不产生大量释放示踪剂。因此可更换电极和神经元的成功记录，沾在几百微米的电极断裂的位置。如果电极堵塞或录音解决方案不填写电极充分提示，噪音会大大增加，应更换电极。进入大脑测试之前插入电极阻抗大大降低非生产性的电极束和节省时间。如果您正试图从一个小区域的脑立体定位记录是至关重要的。我用望远镜连接的记录表，以保持一个固定的立体零。该望远镜是非常有用的，因为可分为记录表，然后经放大观看电极支架放置电极。这允许更换电极的电极和归零的位置非常准确的。
最近的一些研究已经使用juxtacellular神经元标记。11,12有了这个一个电极放置在接近基于神经元记录和神经示踪的特点的神经元方法是弹出。用这种方法的一个明显的潜在的问题是虚假的标签，因为示踪剂可以在电极附近的其他神经元的树突和轴突中。此外，神经元的输入输出关系不能确定，因为细胞外记录的动作电位的产生，不仅可以通过突触的神经元的输入，但神经元的内在属性。与方法在这里报道，神经元是唯一的标记，而微电极实际上是神经元内，因而不存在模糊性染色神经元的神经元活动的归属。标签轴突时，这一点尤为重要，因为微电极的运动，由几微米的杂散标签的结果。此外，亚阈值的事件，包括突触的潜力可以记录从刺穿神经元。
未来的研究结合起来，这种方法诱发运动。例如大脑皮层的刺激，能唤起脑干内的咀嚼运动和记录稳定性，应允许在这些诱发运动神经元细胞内记录和染色。由于这种技术可以用最小的手术干预，也可能是POSSible使用此方法注入体内基因表达的物质，改变。
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Disclosures
对动物的实验是在按照guidlines和设置在实验动物护理和使用（1985年修订的美国国立卫生研究院出版号86-23，）指南“规定的调控和马里兰大学的动物护理和使用委员会。
Acknowledgments
我感谢安东尼泰勒在体内的细胞内记录和一个细胞内染色技术的初步发展的帮助，布朗和大卫麦克斯韦的初步培训。我感谢帮助与collocalization宏M.银。我有许多学者与人合作提供洞察到这种技术的发展，包括R.峡谷，M. Moritani，P.罗，R. Ambalavanar。这项技术是由美国国立卫生研究院拨款DE10132，DE15386和RR017971相当大的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| electromagnetic vibrator | Ling Dynamic Systems | V101 | |
| signal generator | Feedback Systems | PFG605 | capable of producing trapezoidal output signal |
| electrode glass | Sutter Instrument Co. | AF100-68-10 | with filament |
| electrode puller | Sutter Instrument Co. | Model P-2000 or P-80 | |
| biotinamide | Vector Laboratories | SP-1120 | stored at 4°C |
| Texas Red avidin DCS | Vector Laboratories | A-2016 | |
| tetramethlyrhodamine | Molecular Probes, Life Technologies | D-3308 | 3000 molecular weight, lysine fixable |
| mouse anti-synaptophysin antibody | Chemicon International | MAB5258 | |
| fluorescent Nissl stain | Neurotrace, Life Technologies | N-21480 | |
| electrode tester | Winston Electronics | BL-1000-B | to measure electrode impedance |
| electrometer | Axon Instruments | Axoprobe 1A, Axoclamp 2B |
References
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