Summary
Nós descrevemos o uso de um ensaio de células de rato ES base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. O método fornece uma plataforma padronizada, que quantifica a eficiência confiável cardiogênico, e é aplicável ao estudo de linhagens de célula.
Abstract
Diferenciação das células-tronco pluripotentes é rigidamente controlado por regulação temporal e espacial de várias vias de sinalização chave. Um dos obstáculos à sua compreensão tem sido os métodos variados em correlacionar as alterações dos principais eventos de sinalização para a eficiência diferenciação. Descrevemos aqui o uso de um tronco embrionárias de rato ensaio de células (ES), com base para identificar janelas de tempo crítico para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP durante a indução cardiogênico. Marcando para a contratação de corpos embrionárias (EBs) em um formato de placa de 96 poços, podemos rapidamente quantificar a eficiência cardiogênico e identificar janelas de tempo crucial para Wnt / β-catenina e ativação do sinal BMP em um curso de tempo seguintes tratamentos modulador específico. O principal descrito aqui não se limita a indução cardíaca por si só, e pode ser aplicado para o estudo de muitas outras linhagens celulares. Além disso, o formato de 96 poços tem o potencial de ser desenvolvido como um alto throughput, ensaio automatizado para permitir o teste de hipóteses mais sofisticado experimental.
Protocol
1. Corpo formação embrionária (EB), utilizando fundo 96-redonda bem placas de microtitulação
- Cultivar células TE de camundongos em placas de 10 centímetros de cultura de células com o mouse médio de células ES suplementado com LIF.
- Quando as células ES estão prontos para uso (geralmente na confluência 50-70%), remova a mídia ES e lavar as células uma vez com 5ml de PBS estéril.
- Adicionar 2 ml de tripsina 0,05% / EDTA para cada placa e incubar as placas a 37 ° C por 3 ~ 5 minutos, Quench tripsina EDTA com 3 ml de mídia ES.
- Transferência de células para tubos falcon de 50ml e giram a 1000 rpm por 3 minutos.
- Remover o sobrenadante e ressuspender pellet celular com uma quantidade desejada de EB mídia.
- Conte o número de células e diluir as células a 5 x10 3 células / ml no EB mídia.
- Use pipeta multicanal para adicionar 100μl de EB mídia contendo células em cada poço de 96 - round placas de microtitulação.
- Lugar 96 - rodada placas de microtitulação bem em uma incubadora.
2. Identificação de janelas de tempo crítico da via de sinalização chave (s) para cardiogenesis
- Adicionar moduladores de vias de sinalização específica e de controle do veículo em cada poço de placas de microtitulação de 96 poços contendo células-tronco embrionárias em momentos diversos, tais como o dia 0, dia 1, dia 2, dia 3 e dia 4, etc Metade dos poços em cada 96 bem-placa (48 poços) são usados para cada ponto de hora de início do tratamento.
- Lavar a moduladores mudando media EB para cada 48 poços em diferentes pontos de tempo de parada. Por exemplo, para obter dois dias de tratamento para as células ES a partir de dia 0, lavar a moduladores no dia 2. Para qualquer tratamento mais de 48 horas, a mudança de mídia EB suplementado com moduladores fresco a cada dois dias até que os pontos de tempo desejado parar.
- Examine contração EB sob um microscópio após o dia 7. Pontuação dos poços com a contratação EBs como positivos para obter porcentagens de contratação para cada EBs cursos tempo diferente de tratamento.
- Os pontos momento crítico para cardiogenesis ES são os prazos em que continha o maior percentual de contratação EBs tratados por moduladores de sinalização quando comparado com o controle do veículo.
3. Verificação de janelas de tempo de sinalização para cardiogenesis em EBs feita a partir de gotas de suspensão
- Prepare placas de Petri, adicionando com 3-4 ml de PBS para evitar a evaporação.
- Siga os passos 1,1 ~ 1,5 para preparar células-tronco embrionárias em 2.5x10 4 células / ml densidade celular final.
- Despeje a mistura de células bacterianas em prato de fácil acesso. Usando pipeta multicanal, adicione 20 gotas mL (contendo cerca de 500 células) para tampas invertidas. Não permita que as gotas individuais ao toque. Geralmente uma tampa pode caber até 80 gotas. Vire a tampa para trás sobre o prato contendo PBS. Incubar por 24 horas ou 48 horas para permitir a formação EB em uma incubadora.
- Lavar EB formado a partir de gotas de suspensão de cada tampa com 3 ml de mídia e piscina EB 2 tampas de EBs a nova placa de Petri. Adicionar mídia EB para um volume total de 10ml.
- Transferência EBs em suspensão para 0,2% de gelatina revestido de 6 placas bem no dia 4. Em geral 30 EBs são transferidos para cada poço. Adicionar mídia EB para obter o volume de 2 ml final para cada poço.
- Incubar moduladores de sinalização no período de tempo identificados a partir de 96 poços experimentos prato.
- Observe a contração EB sob microscópio após o dia 7 e cardiogenesis pode ser ainda caracterizada por RT-PCR de positividade, e outros, se necessário.
Discussion
O método de gota em suspensão tem sido o método convencional usado para a formação de EB e na diferenciação in vitro. No entanto, é trabalhoso e limita a flexibilidade experimental, devido a preocupações logísticas. Da mesma forma, os resultados são também mais difíceis de validar como a habilidade do pesquisador é crucial para a formação de EB bem sucedido e manipulação como gotas de suspensão. Um método mais simples é formar EBs em uma placa de fundo redondo de 96 poços como um processo de etapa única. Este formato permite a diferenciação in vitro a ser padronizada e pode acomodar mais condições experimentais, devido à facilidade de formação de EB e manipulação downstream (por exemplo, adição ou remoção modulador). Além disso, o formato de 96 poços da placa pode ser otimizado para ser uma ferramenta de triagem eficiente nas células ES mouse.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Veterans Affairs e subvenções NIH 5U01HL100398 e 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
