Ändrad Mus embryonala stamceller baserad analys för att kvantifiera Kardiogen induktion Effektivitet

Summary

Vi beskriver användningen av en mus ES-cell-baserad analys för att identifiera kritiska tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder vid kardiogen induktion. Metoden ger en standardiserad plattform som tillförlitligt kvantifierar kardiogen effektivitet, och det är som gäller för studiet av andra cell linjer.

Abstract

Differentiering av pluripotenta stamceller är hårt styrt av tid och rum reglering av flera viktiga signalvägar. Ett av hindren för dess förståelse har varit varierande metoder korrelera förändringar av viktiga signalsystem händelser till differentiering effektivitet. Vi beskriver här att använda en mus embryonala stamceller (ES) cell-baserad analys för att identifiera kritiska tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder vid kardiogen induktion. Genom poängsättning för upphandlande embryonala organ (EBS) i en 96-brunnar format, kan vi kvantifiera snabbt kardiogen effektiviteten och identifiera avgörande tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder under en tidsperiod efter specifika modulatorn behandlingar. De viktigaste beskrivs här är inte begränsad till hjärt induktion ensam, och kan användas mot studiet av många andra cell linjer. Dessutom har 96-bra format potential att vidareutvecklas som en hög genomströmning, automatiserad analys för att möjliggöra testning av mer sofistikerade experimentella hypoteser.

Protocol

1. Embryonala Body (EB) bildande med 96-rund botten och mikrotiterplattor

1. Väx celler mus ES i kultur 10cm plattorna med musen ES-celler mediet kompletteras med LIF.
2. När ES-celler är klara för användning (i allmänhet med 50-70% sammanflödet), ta bort ES media och skölj celler gång med 5 ml sterilt PBS.
3. Tillsätt 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA till varje tallrik och tallrikar inkubera vid 37 ° C i 3 ~ 5 minuter, Släck trypsin EDTA med 3 ml ES medier.
4. Överför celler till 50ml falk rör och snurra vid 1000 rpm i 3 minuter.
5. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten med önskad mängd EB medier.
6. Räkna mobilnummer och späd celler till 5 x10 ³ celler / ml i EB medier.
7. Använd flerkanalspipett att lägga 100μl EB media som innehåller celler i varje brunn på 96 - runda och mikrotiterplattor.
8. Plats 96 - runda och mikrotiterplattor i en inkubator.

2. Identifiering av kritiska tidsfönster av de viktigaste signalväg (ar) för cardiogenesis

1. Lägg modulatorer av specifika signalvägar och kontroll av fordon i varje brunn på 96-håls mikrotiterplattor med ES-celler vid olika tidpunkter som dag 0, dag 1, dag 2, dag 3 och dag 4, etc. Hälften av brunnar i varje 96 -brunnar (48 brunnar) används för varje start tidpunkt för behandling.
2. Tvätta ur modulatorer genom att ändra EB media för varje 48 brunnar vid olika stopptid poäng. Till exempel, att få två dagars behandling för ES-celler från dag 0, skölj modulatorer vid dag 2. För varje behandling längre än 48 timmar, ändra EB media kompletteras med färsk modulatorer varannan dag tills önskad poäng stopptid.
3. Undersök EB kontraktion under ett mikroskop efter dag 7. Betyg brunnarna med upphandlande EB som positiva för att få procent av upphandlande EB för varje olika kurser behandlingstid.
4. Den kritiska tidpunkter för ES cardiogenesis är de tidsramar som innehöll den högsta andelen av upphandlande EB behandlas genom att signalera modulatorer jämfört med fordonskontroll.

3. Kontroll av tidsfönster av signalering för cardiogenesis i EBS gjorda av hängande droppar

1. Förbered petriskålar genom att tillsätta med 3-4 ml PBS för att förhindra avdunstning.
2. Följ steg 1,1 ~ 1,5 för att förbereda ES-celler vid 2.5x10 ⁴ celler / ml sista celltäthet.
3. Häll cellen blandningen i bakterie-skål för enkel åtkomst. Använda flerkanalspipett, tillsätt 20 l droppar (som innehåller cirka 500 celler) på inverterad lock. Låt inte de enskilda droppar med beröring. Generellt ett lock rymmer upp till 80 droppar. Vänd locket tillbaka över skålen med PBS. Inkubera under 24 timmar eller 48 timmar för att EB bildas i en inkubator.
4. Tvätta EB bildas från hängande droppar från varje lock med 3 ml EB media och pool 2 lock av EBS till en ny petriskål. Lägg EB media till en total volym på 10 ml.
5. Överföring EB i suspension på 0,2% gelatin belagda 6-brunnars plattor på dag 4. I allmänhet 30 EB överförs till varje brunn. Lägg EB media för att få 2 ml slutliga volymen för varje brunn.
6. Inkubera signalering modulatorer vid den tidsperiod som identifierats från 96-brunnar experiment.
7. Observera EB kontraktion under mikroskop efter dag 7 och cardiogenesis kan dessutom karakteriseras genom RT-PCR, immunfärgning och andra, om det behövs.

Discussion

Den droppe Metoden har den konventionella metod som används för EB bildning och in vitro-differentiering. Men det är mödosamt och begränsar experimentella flexibilitet på grund av logistiska problem. På samma sätt, resultaten är också svårare att validera som förmågan att försöksledaren är avgörande för framgångsrika EB bildning och manipulation som hängande droppar. En enklare metod är att bilda strandsandaler en rund botten 96-brunnar som ett enda steg. Detta format möjliggör in vitro differentiering vara standardiserade och kan rymma mer experimentella förhållanden på grund av den enkla EB bildning och nedströms manipulation (t.ex. modulator tillägg eller borttagande). Dessutom kan 96-brunnar format optimeras för att vara ett effektivt verktyg för screening i mus ES-celler.

Materials

Mouse CGR8 cells are mainly used.

ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF.

EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution.