Summary
Descriviamo l'uso di un test delle cellule del mouse ES base per identificare le finestre momento critico per Wnt / β-catenina e il segnale di attivazione BMP durante l'induzione cardiogeno. Il metodo fornisce una piattaforma standardizzata che quantifica l'efficienza cardiogeno affidabile, ed è applicabile allo studio di altre linee cellulari.
Abstract
Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti è strettamente controllato dalla regolamentazione temporale e spaziale di molteplici vie principali di segnalazione. Uno degli ostacoli alla sua comprensione è stata la modalità diverse nel correlare i cambiamenti dei principali eventi di segnalazione per l'efficienza differenziazione. Descriviamo qui l'uso di un topo staminali embrionali (ES) saggio cellula base per identificare le finestre momento critico per Wnt / β-catenina e il segnale di attivazione BMP durante l'induzione cardiogeno. Segnando per il contratto corpi embrionali (EBS) in un formato piatto a 96 pozzetti, a breve potremo quantificare l'efficienza cardiogeno e identificare le finestre momento cruciale per Wnt / β-catenina e segnale di attivazione BMP in un corso di tempo dopo trattamenti modulatore specifico. Il principale qui delineato non si limita alla sola induzione cardiaca, e può essere applicata verso lo studio di molte altre linee cellulari. Inoltre, il formato a 96 pozzetti ha il potenziale per essere ulteriormente sviluppato come un throughput elevato, test automatizzati per consentire la sperimentazione di ipotesi più sofisticate sperimentale.
Protocol
1. Embrionale del corpo (EB) la formazione con basso 96-tondo e micropiastre
- Crescere cellule staminali embrionali del mouse in piastre di coltura cellulare 10 centimetri con il mezzo del mouse cellule ES integrato con LIF.
- Quando le cellule ES sono pronti per l'uso (in genere a 50-70 confluenza%), rimuovere i supporti ES e lavare le cellule una volta con 5 ml di PBS sterile.
- Aggiungere 2 ml 0,05% tripsina / EDTA per ogni piastra e incubare le piastre a 37 ° C per 3 ~ 5 minuti, Quench tripsina EDTA con 3 ml mezzi ES.
- Trasferimento alle cellule di tubi da 50 ml falco e far girare a 1000 giri per 3 minuti.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare con quantità desiderata di EB media.
- Contare il numero di cellulare e diluire le celle a 5 x 10 3 cellule / ml in EB media.
- Usa pipetta multicanale per aggiungere 100μl di EB supporti contenenti le cellule in ciascun pozzetto di 96 - turno piastre microtiter bene.
- Posto 96 - turno micropiastre bene in un incubatore.
2. Identificazione delle finestre momento critico della via di segnalazione chiave (s) per cardiogenesis
- Aggiungi modulatori di specifiche vie di segnalazione e di controllo del veicolo in tutti i pozzetti di piastre a 96 pozzetti microtiter contenente cellule staminali embrionali in vari momenti, come giorno 0, giorno 1, giorno 2, giorno 3 e il 4 ° giorno, metà dei pozzi, ecc per ogni 96 -pozzetti (48 pozzi) sono utilizzati per ogni punto ora di inizio del trattamento.
- Lavare i modulatori cambiando i media EB per ogni 48 pozzi in diversi punti di tempo di arresto. Ad esempio, per ottenere due trattamenti al giorno per le cellule staminali embrionali a partire dal giorno 0, lavare modulatori al giorno 2. Per qualsiasi prestazione per più di 48 ore, il cambiamento dei media EB integrato con modulatori fresca ogni due giorni fino a quando i punti di fermare il tempo desiderato.
- Esaminare contrazione EB al microscopio dopo giorno 7. Punteggio ottenuto i pozzetti con contraenti EB come positivi per ottenere percentuali di contrarre l'EBS per ogni diversi corsi tempo di trattamento.
- I punti critici per tempo cardiogenesis ES sono i tempi in cui conteneva la più alta percentuale di contrarre EB trattate con modulatori di segnale rispetto al controllo del veicolo.
3. Verifica delle finestre temporali di segnalazione per cardiogenesis in EBS fatto da gocce appese
- Preparare Petri aggiungendo con 3-4 ml di PBS per evitare l'evaporazione.
- Seguire i punti da 1,1 ~ 1,5 per preparare le cellule ES a 2.5x10 4 cellule / ml densità cellulare finale.
- Versare il composto nel piatto cellula batterica per un facile accesso. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 gocce microlitri (contenente circa 500 cellule) su coperchi invertita. Non lasciare che le goccioline individuale al tatto. Generalmente un coperchio può andare bene fino a 80 gocce. Capovolgere il coperchio sopra il piatto contenente PBS. Incubare per 24 ore o 48 ore per permettere la formazione EB in un incubatore.
- Lavare EB formato da appendere gocce da ogni coperchio con 3 ml di media EB e piscina 2 coperchi di EBS per un nuovo piatto di Petri. Aggiungi mezzi EB ad un volume totale di 10 ml.
- EB trasferimento in sospensione sul 0,2% di gelatina rivestito da 6 pozzetti al giorno 4. In generale 30 EBS sono trasferiti a ciascun pozzetto. Aggiungi EB mezzi per ottenere il volume finale di 2 ml per ogni bene.
- Incubare segnalazione modulatori al periodo di tempo individuato da 96 pozzetti esperimenti piastra.
- Osservare la contrazione EB al microscopio dopo giorno 7 e cardiogenesis può essere ulteriormente caratterizzato mediante RT-PCR, immunoistochimica e altri, se necessario.
Discussion
Il metodo goccia pendente è stato il metodo convenzionale utilizzato per la formazione EB e differenziamento in vitro. Tuttavia, è laborioso e limita la flessibilità di sperimentazione a causa di problemi logistici. Per lo stesso motivo, i risultati sono anche più difficili da convalidare come l'abilità dello sperimentatore è cruciale per la formazione di EB successo e manipolazione come gocce. Un metodo più semplice è quello di formare EBS in un pallone a fondo piatto 96-così come un singolo passo del processo. Questo formato consente di differenziamento in vitro di essere standardizzati e possono ospitare più condizioni sperimentali a causa della facilità di formazione di EB e la manipolazione a valle (modulatore ad esempio aggiunta o la rimozione). Inoltre, il formato a 96 pozzetti piastra può essere ottimizzato per essere un efficiente strumento di screening in cellule di topo ES.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Veterans Affairs e sovvenzioni NIH 5U01HL100398 e 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
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