Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת תפוקה גבוהה של הידרוליזה אנזימטית אשר מנצל קורא microplate למדוד ולסווג זרחן אדמה כמו P monoesters, diesters P ו פ אורגניים עד 96 דגימות ניתן למדוד בו זמנית במעבדה סטנדרטית.
Abstract
סוגים רבים של (P) מולקולות אורגניות זרחן קיימות דגימות סביבתיות 1. מסורתית מדידות P אינם מזהים אלה תרכובות אורגניות P מאז הם לא מגיבים עם ריאגנטים colorimetric 2,3. הידרוליזה אנזימתי (EH) היא שיטה המתעוררים מדויק באפיון צורות P אורגני דגימות סביבתיות 4,5. שיטה זו היא ניצחה רק על ידי זרחן-31 ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית (31 P-NMR), שיטה כי זה יקר ודורש training6 טכני המתמחה דיוק. יש לנו להתאים שיטה הידרוליזה אנזימטית מסוגל למדוד שלוש כיתות של זרחן (monoester P, P ו-P diester אורגניים) למערכת microplate קורא 7. שיטה זו מספקת לחוקרים עם אמצעי מהיר, מדויק, סביר ידידותי למשתמש למדוד מינים P בקרקע, משקעים, וזבלים, ואם מרוכז, דגימות מים. זוהי השיטה היחידה תפוקה גבוהה למדידת טפסים אנזימים לביליות של P אורגני שניתן לבצע במעבדה סטנדרטית. את הנתונים המתקבלים מספק תובנה למדענים ללמוד תוכן מערכת מזין ואת הפוטנציאל eutrophication.
Protocol
1. זרחן Extraction
- הכן פתרון 1 ליטר של הידרוקסיד M 0.25 נתרן (NaOH, 40.00 g / mol) + 0.05 M חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 292.24 g / mol).
- הוסף 30 מ"ל של EDTA פתרון + NaOH עד 2 גרם של אדמה רטובה או יבשה / לדוגמה צינור חרוטי 50 מ"ל.
- דגירה בהתרגשות עבור 16 שעות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה 3000 XG במשך 3 דקות.
2. תמצית לדוגמה pH התאמת
- העברת aliquot 0.1 מ"ל על צינור 1.5 מיקרו צנטריפוגות מ"ל.
- הוספת 0.017 מ"ל של חומצה אצטית M 2.5, 0.144 מ"ל של חיץ M 0.4 אצטט (70.5% של נתרן אצטט [CH 3 COONa, 82.03 g / mol] ו 29.5% של חומצה אצטית, pH 5.0), ו 0.739 מ"ל מים deionized.
- נפח סופי של תמצית מותאם יהיה 1 מ"ל ו pH הסופי יהיה 5.0.
3. מלאי אנזימים פתרון הכנה
- הכן 1 ליטר של אצטט M 0.1 נתרן (CH 3 COONa, 82.03 g / mol) פתרון, pH 5.0.
- הכן 2 x 10 phosphatase מ"ל חומצה פתרונות המניות למאגר נתרן אצטט מוכן בשלב 3.1 כך ריכוזי הסופי כל 0.5 יחידות / מ"ל.
Phosphatase חומצה Type I מ Triticum aestivum (נבט חיטה, GP, בדרך כלל 0.5 מ"ג U-1 מוצק, EC 3.1.3.2)
Acid phosphatase סוג IV-S מ Solanum tuberosum (תפוחי אדמה, PP, בדרך כלל 4.6 מ"ג U-1 מוצק, EC 3.1.3.2)
* יחידות הפעילות שצוינו על ידי הספק שבו 1 יחידות מוגדר לשחרור micromole 1 של orthophosphate לפתרון לשעה 37 ° C. - מחדש lyophilized nuclease P1 (EC 3.1.30.1) מ Penicillium citrinum (פטריות; NP1, בדרך כלל 500 מ"ג U -1 מוצק) ב מ"ל אחד deionized מים זה כעת ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
- פיפטה NP1 לתוך אחד הצינורות 10 מ"ל מוכן בשלב 3.2 כזה ריכוז הסופי הוא 2.5 יחידות / מ"ל NP1: לערבב בעדינות מספר פעמים על ידי היפוך.
- צנטריפוגה שני פתרונות 10 מ"ל אנזים 3000 XG במשך 30 דקות.
4. P עקומת כיול שולטת
- הכן 1 ליטר של פוספט אשלגן 1 מ"מ (K2HPO4, 174.18 g / mol) פתרון המניות.
- הוסף 1 מ"ל של 1 mM אשלגן פתרון מניות פוספט צינור 1.5 צנטריפוגות מ"ל ולבצע seven 0.5 דילולים סדרתי מ"ל.
- מחק את הצינור הראשון אז יש לך 7 דילולים הנעים בין 20 nmol-nmol 0.625 פ
- העברת 80 μL מהצינור כל כפולים שורות ב - H צלחת 96-היטב סטנדרטי.
- הוסף 80 μL של חיץ נתרן אצטט (סעיף 3.1) עד שורת עמודים 11 ו -12, זה הוא 0 nmol נקודה P כיול.
- כל עמודה 11 ו 12 מכיל כעת 8 דגימות התייחסות nmol מ 0 עד 20 פוספטים אנאורגניים nmol.
- טור 10 יכיל את הפקדים הבאים:
- הוסף 40μL PP + פתרון GP אנזים + 40 נתרן אצטט μL חיץ (סעיף 3.1) את שלושת הבארות הראשון בעמודה 10.
- הוסף 40 μL PP + + GP NP1 פתרון אנזים + 40 נתרן אצטט μL חיץ לשלוש בארות הבא.
- הוסף 40 נתרן אצטט μL תמיסה המכילה 10 glucose-6 nmol פוספט (C 6 H 11 O 2 Na 9 P • xH 2 O, 304.1 g / mol) + 40 μL PP + פתרון GP אנזים אחד היטב היטב את הגמר ב 10 טור פתרון להוסיף נתרן אצטט במקום פתרון האנזים.
5. לדוגמה + אנזימים דגירה
- כל נבדק מדגם יתפוס הראשון 9 בארות בשורה 1 צלחת 96-היטב סטנדרטי.
- הפץ 40 μL של ה-pH המותאמת תמציות מדגם מתוך סעיף 2 לבארות 1-9 של עד 8 שורות.
- אחרי הכל דגימות הופצו * להשתמש פיפטה רב להפיץ PP + פתרון GP אנזים לעמודות 1-3, PP + + GP NP1 לעמודות 4-6 ו נתרן אצטט חיץ (מוכן בסעיף 3.1) לעמודות 7-9.
* שלב זה חייב להתבצע במהירות כדי להבטיח כל הדגימות לקבל זמן הדגירה המקבילה. - מכסים את צלחת 96-היטב עם מכסה דגימות דגירה + פתרונות האנזים, בקרות עקומת כיול בדיוק 1 שעות בשעה 37 ° C.
6. מדידה של Colorimetric פורסם ו-P רקע אורגניים
- הכן 50 מ"ל של כל אחד מן הפתרונות הבאים במים deionized:
פתרון: * 0.1 חומצה אסקורבית M (C6H8O6, 176.12 g / mol) + חומצה Trichloroacetic 0.5m (Cl3CCOOH, 163.39 g / mol)
פתרון ב ': 0.01 molybdate M אמוניום ((NH4) 2MoO4, 196.01 g / mol)
פתרון ג': 0.1 M ציטרט הנתרן (הוק (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294.10 g / mol) + 0.2 arsenate M נתרן (NaAsO2, 129.91 g / mol) + 5% חומצה אצטית קרחונית
(CH3CO2H, 60.05 g / mol) * הפתרון חייב להיות מוכן מדי יום. - הוסף 25 μL הפתרון SDS, 100 μL של פתרון, 20 μL של B פתרון ו 50 μL של C פתרון לכל בארות 96-pl טובאכלו. עשה זאת במהירות עם טפטפת רב.
- מכסים את הצלחת דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- מדוד את ספיגת ב 850 ננומטר כל קורא מיקרו צלחת מתכונן.
7. סיווג של תרכובות P
- ייבוא נתונים גולמיים לתוך יישום גיליונות אלקטרוניים (כגון Microsoft Excel).
- מגרש זרחן אורגני עקומת כיול: 0-40 nmol P על ציר ה-x לבין הממוצע של מדידות ספיגת לשכפל על ציר ה-Y.
- ביצוע רגרסיה ליניארית ולמצוא את המשוואה של קו בכושר הטוב ביותר.
- טורים 1-3: ישירות להחיל את עקומת כיול, זה הרקע אורגניים פ
- טורים 4-6: ממוצע מדגם ערכים בשלושה עותקים ולחסר את שולטת (פתרון אנזים + אורגניים P רקע) מ ברוטו ספיגת-P זו נגזרת מן hydrolysable monoesters P.
- טורים 7-9: כמו 7.5 פרט לחסר ספיגת ערכים מעמודות 4-6 - זה P מ hydrolysable diesters P.
- המרת נתונים כדי ספיגת nmol P שפורסמו על ידי יישום משוואת כיול.
- nmol P פרסמה יכול להיות קשור בחזרה P מ"ג / ק"ג של אדמה המקורי. לחלופין, בהערכת הפרופורציות של כל שיעור P יכול להיות גם שימושי גישה לניתוח נתונים.
8. נציג תוצאות:
בדיקה חזותית מהירה של צלחת 96-היטב לאחר הכימיה colorimetric יציע רמזים אם ההליך בוצע כראוי. הדבר הראשון שיש לבדוק הוא את רמת הנוזל היטב על ידי סריקת כל פרופיל בצד הצלחת. לא צריך להיות בדיוק 275 μL של ריאגנטים בבארות כל. בשלב הבא, לבדוק ויזואלית את הצבע של בארות מדגם בשלושה עותקים ולשכפל בארות כיול. אלה לשכפל טכני צריך להיות באותו גוון של כחול. לאחר מכן להחיל את עקומת כיול על שתי בארות המכילה גלוקוז -6 פוספט ואמת הם שחררו את כל 10 nmol של פ אורגניים אחרי P חילוץ בסך הכל כבר נמדד באמצעות ICP-OES או שיטה חלופית, ודא P הכולל ערכים מחושבים באמצעות פרוטוקול לא יעלה על סכום P זה היה חילוץ.
הערה: ניהול נתונים זהירות בגיליון האלקטרוני יעזור להישמר מפני טעויות כמותי. אתה תהיה התמודדות עם הרבה מספרים בבת אחת, כך יוצר תבנית יהיה זמן טוב בילו.
באיור 1. צלחת 96-היטב מציג תוצאות עבור 8 דגימות (שורות א.ה.) לבין עקומת כיול (עמודות 11 ו 12). פקדים הם בעמודה 10. עוצמת צבע להגדיל בין עמודות 1-3 ו 4-6 בשל תרכובות monoester הידרוליזה P, בין עמודות 4-6 ו 7-9 בשל תרכובות P הידרוליזה diester.
איור 2. התפלגות כיתות P ב 0.25-M לחלץ NaOH 0.05 M EDTA מדגם אדמה ורמונט באמצעות תפוקה גבוהה הידרוליזה אנזימטית. ברים שגיאה מצביעים סטיית תקן, n = 3.
Discussion
מעצם טבעו, שיטה מהירה באמצעות בנפחים קטנים דורש טיפול רב. לכן השלבים הקריטיים ביותר הם אלה הכוללים פתרונות pipetting לצלחת. מדויק, והכי חשוב, הטכניקה פיפטה עקביים הם חיוניים להצלחה של assay זה.
מיצוי NaOH-EDTA יאפשר ביותר P בדגימות רבות להתאפיין לשלושה סוגים: orthophosphate, monoester P ו diester קרקעות פ, וזבלים, משקעים או כל מדגם סביבתיים אחרים המכילה NaOH-EDTA לחילוץ-P ניתן לאפיין . צורות P בדגימות איכות הסביבה אינם יציבים בהכרח טכניקה זו תבטיח דגימות מאופיינים לפני דגימות נפגמו ללא צורך להעסיק צבא של חוקרים.
Assay זו מתאימה במיוחד כאשר מספר גדול של דגימות הן להיות מעובד. הצרכים מגיב ועל דרישות השטח כבר scaled למטה לרמה סבירה (למשל 1.5 microcentrifuge מ"ל צינורות במקום 50 מ"ל צלוחיות זכוכית). הסתגלות זו גם מגבלות ייצור פסולת.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים USGS לבין משאבי מים ורמונט אגם המרכז ללימודי למתן מימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
