Summary
このプロトコルは、96サンプルのPモノエステル、Pのジエステルと無機P.アップが標準的な実験で一度に測定できるように土壌のリンを測定し、分類するためのマイクロプレートリーダーを利用して酵素加水分解のハイスループット法を説明します。
Abstract
有機燐（P）は、分子の多くの種類は、環境試料1に存在します。彼らは比色試薬2,3と反応しないため、従来のPの測定は、これらの有機P化合物を検出しません。酵素加水分解は、（EH）正確に4,5の環境試料中の有機Pの形態を特徴づけるための新しい方法です。このメソッドは、リン- 31核磁気共鳴分光法（31 P - NMR）、高価であり、専門的な技術training6を必要とするメソッドによって精度に捏造されています。我々は、マイクロプレートリーダーシステム7にリンの3つのクラス（モノエステルP、ジエステルP及び無機P）を測定できる酵素加水分解法を適応している。このメソッドは、土壌、堆積物、肥料や、場合集中、水生サンプルでPの種を測定するために、高速で正確、手頃な価格とユーザーフレンドリーな手段を研究者に提供します。これは標準の実験室で行うことができる有機Pの形態と酵素不安定性を測定するための唯一のハイスループット法である。結果のデータは、システム栄養成分と富栄養化の可能性を研究する科学者に洞察力を提供します。
Protocol
1。リン抽出
- 0.25Mの水酸化ナトリウム（NaOH、40.00グラム/モル）+ 0.05 Mエチレンジアミン四酢酸（EDTA、292.24グラム/モル）の1L溶液を調製します。
- 50 mLコニカルチューブに濡れたまたは乾燥土壌/サンプル2gのに水酸化ナトリウム+ EDTA溶液30 mLを加え。
- 室温で16時間攪拌しながらインキュベートします。
- 3分間3000 × gで遠心する。
2。サンプルの抽出pHの調整
- 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに0.1 mLずつを転送します。
- 2.5 M酢酸0.017 mLを、0.4 M酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム[CH 3 COONa、82.03グラム/モル]と酢酸の29.5％、pHは5.0 70.5％）の0.144 mLを加え、脱イオン水の0.739 mLを加え。
- 調整された抽出物の最終容量は1mlになり、最終pHは5.0になります。
3。酵素のストック溶液の調製
- 0.1 M酢酸ナトリウム（CH 3 COONa、82.03グラム/モル）溶液、pH 5.0 1 Lを準備します。
- 最終濃度がそれぞれ0.5単位/ mLとなるようにステップ3.1で作成した酢酸ナトリウム緩衝液で2 × 10 mLの酸性ホスファターゼのストック溶液を準備します。
酸性ホスファターゼは、 コムギ （; GP、一般的に0.5 U MG - 1固体、EC 3.1.3.2小麦胚芽）からIを入力
ジャガイモから酸性ホスファターゼタイプIV - S（ジャガイモ、PP、一般的に4.6 U MG - 1固体、EC 3.1.3.2）
活動の*単位は、1ユニットは37℃で時間あたりのソリューションにオルトリン酸の1マイクロモルの解放と定義されているサプライヤー℃で規定されています - いずれかの溶液に脱イオン水、これが現在4℃で保存できますC今後の使用のため、再構成するには、 ペニシリウムシト （NP1、一般的には500 Uミリグラム-1固体菌類）からヌクレアーゼP1（EC 3.1.30.1）を凍結乾燥する。
- 最終濃度が2.5単位/ mL NP1となるように、ステップ3.2で作成した10 mLのチューブの1本ピペットNP1は、ゆるやかに転倒数回で混ぜる。
- 2つの10 mLの酵素液を30分間3000 × gで遠心する。
4。 Pキャリブレーションカーブとコントロール
- 1 mMのリン酸カリウム（K2HPO4、174.18グラム/モル）ストック溶液の1リットルを準備します。
- 1.5 mLの遠心管に1 mMリン酸カリウム原液1 mLを追加し、7つの0.5 mLの希釈を行う。
- を20 nmolの- 0.625 nmolのPからまで7段階希釈を持っているように、最初にチューブを捨てる
- 標準の96ウェルプレートのH - 行Bに重複して各チューブから80μLを転送する。
- 列の11と12この値が0 nmolのPのキャリブレーションポイントです。の行に酢酸ナトリウム緩衝液（セクション3.1）80μLを追加
- 各列11と12は0にナノモルから20 nmolの無機リン酸〜8参照のサンプルが含まれています。
- 列10は、次のコントロールが含まれます。
- 10列の最初の3つのウェルに40μlのPP + GPの酵素溶液+ 40μL酢酸ナトリウム緩衝液（セクション3.1）を追加します。
- 40μLPP + GP + NP1酵素液+次の3つのウエルに40μLの酢酸ナトリウム緩衝液を追加します。
- 井戸一つにし、最終的に10 nmolのグルコース-6リン酸（C 6 H 11のNa 2 O 9 P • XH 2 O、304.1グラム/モル）+ 40μLPP + GPの酵素溶液を含む40μLの酢酸ナトリウム溶液を加えるコラム10に酢酸ナトリウム溶液の代わりに酵素溶液を加える。
5。サンプル+酵素のインキュベーション
- テスト中の各サンプルは、標準の96ウェルプレートの1列の最初の9井戸を占有します。
- 最大8行までに第2節から井戸1-9 pH調整サンプルの抽出物40μLを配布する。
- 後にすべてのサンプルは*が列4-6および酢酸ナトリウム緩衝液（セクション3.1で調製したもの）にカラム7-9 PP + GP + NP1 ,1 - 3列にPP + GPの酵素溶液を配布するためにマルチチャンネルピペットを使用して配布されている。
*この手順は、すべてのサンプルと同等のインキュベーション時間を取得を保証するために迅速に実行する必要があります。 - 蓋とインキュベートサンプル付き96ウェルプレート+酵素液、コントロール及び検量線37を正確に1時間℃をカバー
6。リリースおよび背景無機Pの比色測定
- 脱イオン水に以下のソリューションの各50 mLを準備します。
ソリューション*：0.1 Mのアスコルビン酸（C6H8O6、176.12グラム/モル）+ 0.5Mトリクロロ酢酸（Cl3CCOOH、163.39グラム/モル）
解決策B：0.01 Mモリブデン酸アンモニウム（（NH4）2MoO4、196.01グラム/モル）
解決策C：0.1 Mクエン酸ナトリウム（HOC（COONa）（CH2COONa）2 2H2O、294.10グラム/モル）+ 0.2 Mのヒ酸ナトリウム（NaAsO2、129.91グラム/モル）+ 5％氷酢酸
（CH3CO2H、60.05グラム/モル）*ソリューションは、毎日準備しておく必要があります。 - 96ウェルPLで全てのウェルにB液、50μLのと溶液Cの、20μLソリューションSDS、液100μLの25μLを追加食べた。マルチチャンネルピペットで急速にこれを行います。
- プレートを覆い、室温で30分間インキュベートする。
- 任意のチューナブルマイクロプレートリーダーで850 nmで吸光度を測定します。
7。 P化合物の分類
- スプレッドシートアプリケーション（Microsoft Excelなど）に生データをインポートします。
- x軸に0から40 nmolのPとy軸上の重複した吸光度測定値の平均：無機リンの検量線をプロットします。
- 線形回帰を実行し、最適の線の方程式を見つける。
- 1から3列：直接検量線 - これはバックグラウンド無機Pの適用
- 列4-6：平均三連のサンプル値とP加水分解性Pのモノエステルから誘導されるグロス - これは吸光度からコントロール（酵素溶液+背景の無機P）を差し引く。
- 列7-9：列4-6減算の吸光度値を除いて7.5と同じです - これは加水分解性PのジエステルからPです。
- 校正式を適用してリリースさnmolのPへの吸光度データを変換します。
- nmolのPはmg P /元土壌のkgに戻って関連することができますリリース。また、各Pのクラスの割合を評価することも、データを分析するための有用なアプローチかもしれません。
8。代表的な結果：
比色化学後に96ウェルプレートの迅速な目視検査は、手順が正しく行われたか否かに手がかりを提供します。最初に確認することは板の側面のプロフィールをスキャンすることによって、各ウェル中の液体のレベルです。すべてのウェルに試薬を正確に275μLがあるはずです。次に、視覚的に三連のサンプルウェルと重複してキャリブレーションの井戸の色を検査する。これらの技術的複製は、青の同じ色でなければなりません。次のグルコース6リン酸を含む二つのウェルに検量線を適用し、それらが全体の抽出されたPは、ICP - OESまたは別の方法を用いて測定された後、これを用いて計算された合計Pが値を確認して無機Pの全10 nmolのリリースを確認してくださいプロトコルは、抽出されたPの量を超えないようにしてください。
注：スプレッドシート内の慎重なデータ管理は定量的なエラーを防ぐ助けになる。一度に数が多いに対処されるので、テンプレートを作成することは十分に費やした時間となります。
図1 8つのサンプル（行AH）と較正曲線（カラム11および12）の結果を示す96ウェルプレート。コントロールは列10になります。列1から3および4-6間の色の強度の増加は、列4-6と7月9日の間に、加水分解モノエステルのP化合物が原因である加水分解ジエステルのP化合物によるものです。
図2ハイスループット酵素加水分解を使用してバーモント州の土壌試料の0.25 M水酸化ナトリウム- 0.05MのEDTA抽出物中のPクラスの分布。エラーバーは標準偏差、n = 3のを示している。
Discussion
まさにその性質によって、少量を使用して迅速な方法は、細心の注意が必要です。したがって、最も重要なステップは、プレート上にピペットのソリューションを含むものです。正確な、そして最も重要なことは、一貫性のあるピペットのテクニックは、このアッセイの成功に不可欠です。
水酸化ナトリウム- EDTAの抽出は、多くの試料のPの大部分は三つのクラスに特徴付けできるようになります：オルトリン酸、モノエステルPおよびジエステルP.土壌、肥料、堆積物又はNaOH - EDTA -抽出Pを含む任意の他の環境サンプルを特徴づけることができる。環境試料中のP形は必ずしも安定ではなく、この手法は、サンプルは研究者の軍隊を採用することなく、危険にさらされる前にサンプルが特徴とされていることを確認します。
多数のサンプルが処理されるときに、このアッセイは特に適しています。試薬の必要性と容量の要件は、管理可能なレベル（例えば、1.5 mlのマイクロチューブではなく、50mLのガラス製のフラスコ）にスケールダウンされています。この適応はまた、廃棄物の生産を制限する。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、USGSとバーモント州の水資源と資金を提供するための湖研究センターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
