Summary
यह प्रोटोकॉल उच्च throughput एंजाइमी hydrolysis है कि एक microplate पाठक के इस्तेमाल को मापने के लिए और 96 के नमूने के पी monoesters, पी diesters और अकार्बनिक पी. के रूप में मिट्टी फास्फोरस एक मानक प्रयोगशाला में एक समय पर मापा जा सकता है है वर्गीकृत करने की एक विधि का वर्णन करता है.
Abstract
कार्बनिक फास्फोरस अणुओं (पी) के कई प्रकार के पर्यावरण एक नमूने में मौजूद हैं . पारंपरिक पी माप इन जैविक पी यौगिकों का पता नहीं लगा क्योंकि वे वर्णमिति 2,3 अभिकर्मकों के साथ कोई प्रतिक्रिया नहीं करते. Enzymatic hydrolysis (एह) सही पर्यावरण 4,5 नमूनों में जैविक पी रूपों निस्र्पक के लिए एक उभरती हुई विधि है . इस पद्धति का ही फास्फोरस 31 परमाणु चुंबकीय अनुनाद (31 पी एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी एक तरीका है कि महंगा है और विशेष तकनीकी training6 की आवश्यकता द्वारा सटीकता में मात है . हम एक enzymatic hydrolysis एक microplate रीडर 7 प्रणाली फास्फोरस के तीन वर्गों (monoester पी, diester पी और अकार्बनिक पी) को मापने के लिए सक्षम तरीका अनुकूलित है. यह विधि एक तेजी से, सही, सस्ती और उपयोगकर्ता के अनुकूल मिट्टी, अवसादों, खाद और, अगर केंद्रित, जलीय नमूनों में पी प्रजातियों को मापने का मतलब के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है. यह केवल रूपों और जैविक पी के एंजाइम lability है कि एक मानक प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है है मापने के लिए उच्च throughput विधि है. परिणामी डेटा सिस्टम के पोषक तत्व सामग्री और eutrophication क्षमता का अध्ययन वैज्ञानिकों को अंतर्दृष्टि प्रदान करता है.
Protocol
1. फास्फोरस निकालना
- 0.25 एम सोडियम (NaOH, 40.00 छ / mol) हीड्राकसीड + 0.05 एम Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, 292.24 छ / mol) के एक 1L समाधान तैयार है.
- NaOH + EDTA गीला या सूखे / 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में मिट्टी के नमूने के 2 जी के लिए समाधान के 30 एमएल जोड़ें.
- आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 16 घंटे के लिए सेते हैं.
- 3 मिनट के लिए 3000 XG अपकेंद्रित्र.
2. नमूना निकालें पीएच समायोजन
- एक 1.5 एमएल सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब एक 0.1 एमएल विभाज्य स्थानांतरण.
- 2.5 एम एसिटिक एसिड की एमएल 0.017, 0.144 एमएल 0.4 एम एसीटेट बफर (सोडियम एसीटेट के 70.5% [CH 3 COONa, 82.03 छ / mol] और एसिटिक एसिड के 29.5%, 5.0 पीएच), और विआयनीकृत पानी की 0.739 एमएल. जोड़ें
- समायोजित निकालने के अंतिम मात्रा 1 एमएल हो और अंतिम पीएच 5.0 हो जाएगा.
3. एनजाइम स्टॉक समाधान तैयार
- 0.1 एम सोडियम एसीटेट (सीएच COONa 3, 82.03 छ / mol) समाधान, 5.0 पीएच 1 एल तैयार करें.
- सोडियम एसीटेट 3.1 ऐसी है कि अंतिम सांद्रता प्रत्येक 0.5 इकाइयों / एमएल कदम में तैयार बफर में 2 एक्स 10 एमएल एसिड फॉस्फेट शेयर समाधान तैयार करें.
एसिड फॉस्फेट मैं Triticum aestivum (; जीपी, आम तौर पर 0.5 यू मिलीग्राम-1 ठोस, चुनाव आयोग 3.1.3.2 गेहूं रोगाणु) से टाइप करें
Solanum tuberosum से एसिड फॉस्फेट चतुर्थ एस प्रकार (आलू, पीपी, आम तौर पर 4.6 यू मिलीग्राम एक ठोस, चुनाव आयोग 3.1.3.2)
* गतिविधि की इकाइयों आपूर्तिकर्ता जहां एक यूनिट प्रति घंटे समाधान के लिए orthophosphate के 1 micromole की मुक्ति के रूप में 37 में परिभाषित किया गया है डिग्री सेल्सियस के द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं - एक की एमएल में पानी विआयनीकृत यह अब 4 पर भंडारित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए, reconstitute पेनिसिलियम citrinum (NP1, आम तौर पर 500 यू मिलीग्राम -1 ठोस कवक) से nuclease P1 (3.1.30.1 ईसी) lyophilized .
- 10 एमएल 3.2 जैसे कि अंतिम एकाग्रता 2.5 इकाइयों / एमएल NP1 कदम में तैयार ट्यूबों के रूप में पिपेट NP1, धीरे inverting कई बार द्वारा मिश्रण.
- 30 मिनट के लिए दो 10 एमएल एंजाइम समाधान 3000 XG अपकेंद्रित्र.
4. पी अंशांकन वक्र और नियंत्रण
- 1 1 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट के एल (K2HPO4, 174.18 छ / mol) शेयर समाधान तैयार है.
- 1 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट शेयर एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब समाधान के 1 एमएल जोड़ें और सात 0.5 एमएल धारावाहिक dilutions प्रदर्शन.
- पहली ट्यूब त्यागें तो आप 7 dilutions लेकर 20 से nmol 0.625 nmol पी.
- एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली के एच - प्रत्येक ट्यूब से पंक्तियों बी को दो प्रतियों में 80 μL स्थानांतरण.
- सोडियम एसीटेट बफर (3.1 खंड) के 80 μL जोड़ें के लिए 11 स्तंभ और 12-इस nmol 0 पी अंशांकन बिंदु है. एक पंक्ति
- अब हर 11 स्तंभ और 12 8 0 nmol से 20 nmol अकार्बनिक फॉस्फेट के लिए संदर्भ के नमूने शामिल हैं.
- 10 कॉलम निम्नलिखित नियंत्रण शामिल होंगे:
- 10 स्तंभ में पहली तीन कुओं के लिए 40μL पीपी + जीपी एंजाइम + 40 μL सोडियम एसीटेट बफर (3.1 अनुभाग) समाधान जोड़ें.
- 40 μL पीपी + GP + NP1 एंजाइम + 40 μL सोडियम एसीटेट अगले तीन कुओं के लिए बफर समाधान जोड़ें.
- 40 μL सोडियम एसीटेट 10 nmol ग्लूकोज 6 फॉस्फेट (6 सी एच 11 ना 2 हे 9 • पी XH 2 हे, 304.1 छ / mol) 40 + μL पीपी + GP एंजाइम एक अच्छी तरह से और अंतिम अच्छी तरह समाधान युक्त समाधान जोड़ें स्तम्भ 10 एंजाइम समाधान के बजाय जोड़ने के सोडियम एसीटेट समाधान में.
5. नमूना + एनजाइम ऊष्मायन
- प्रत्येक नमूना परीक्षण किया जा रहा है एक पंक्ति में एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली के पहले 9 कुओं पर कब्जा होगा.
- धारा 2 से कुओं 1-9 पीएच समायोजित नमूना के अर्क के 40 μL वितरित 8 पंक्तियों में.
- के बाद सभी नमूने वितरित किया गया है * एक multichannel विंदुक का उपयोग करने के लिए पीपी + जीपी एंजाइम स्तंभों का हल 1-3, पीपी जीपी + + NP1 4-6 कॉलम और सोडियम एसीटेट 7-9 स्तंभों के लिए बफर (3.1 अनुभाग में तैयार) को वितरित
* इस कदम को तेजी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए विश्वास दिलाता हूं सभी नमूनों के बराबर ऊष्मायन समय मिलता है. - कवर एक ढक्कन और सेते नमूनों के साथ 96 अच्छी तरह से थाली + एंजाइम समाधान, नियंत्रण और अंशांकन वक्र घंटा 1 वास्तव में 37 डिग्री सेल्सियस
6. जारी की है और पृष्ठभूमि अकार्बनिक पी के वर्णमिति मापन
- विआयनीकृत जल में निम्नलिखित समाधान के प्रत्येक के 50 एमएल तैयार:
0.1 एम ascorbic एसिड (C6H8O6, 176.12 छ / mol) + 0.5m trichloroacetic एसिड (Cl3CCOOH, 163.39 छ / mol): एक * समाधान
समाधान बी: 0.01 एम अमोनियम molybdate ((NH4) 2MoO4, 196.01 छ / mol)
समाधान सी: 0.1 एम सोडियम साइट्रेट (अस्थायी (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294.10 छ / mol) + 0.2 एम सोडियम arsenate (NaAsO2, 129.91 छ / mol) + 5% हिमनदों एसिटिक एसिड
(CH3CO2H, 60.05 छ / mol) * समाधान एक दैनिक तैयार रहना चाहिए. - समाधान एसडीएस के 25 μL, समाधान की 100 μL जोड़ें, समाधान बी और 50 μL और समाधान सी के सभी कुओं को 20 μL 96 अच्छी तरह pl मेंखा लिया. इस तेजी से एक multichannel विंदुक के साथ.
- प्लेट कवर और कमरे के तापमान पर 30 मिनट सेते हैं.
- किसी भी tunable पाठक सूक्ष्म प्लेट में 850 एनएम पर absorbance के उपाय.
7. पी कम्पाउँड का वर्गीकरण
- एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग (जैसे Microsoft Excel में) में कच्चे डेटा आयात करें.
- X-अक्ष पर 0 से 40 nmol पी और y-अक्ष पर डुप्लिकेट absorbance के माप का मतलब: अकार्बनिक फास्फोरस अंशांकन वक्र प्लॉट.
- एक रेखीय प्रतिगमन प्रदर्शन और सबसे अच्छा फिट की लाइन के समीकरण लगता है.
- कॉलम 1-3: प्रत्यक्ष अंशांकन लागू वक्र इस पृष्ठभूमि है अकार्बनिक पी.
- 4-6 कॉलम: औसत तीन प्रतियों नमूना मूल्यों और सकल absorbance के इस पी hydrolysable पी monoesters से ली गई है से बाहर नियंत्रण (एंजाइम + समाधान पृष्ठभूमि अकार्बनिक पी) घटाना
- 7-9 कॉलम: 4-6 स्तंभों से घटाना absorbance के मूल्यों को छोड़कर 7.5 के रूप में भी - इस hydrolysable पी diesters से पी है.
- Nmol पी अंशांकन समीकरण को लागू करने के द्वारा जारी absorbance डेटा कनवर्ट करें.
- nmol पी जारी वापस मिलीग्राम पी / मूल मिट्टी के kg संबंधित हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक पी वर्ग के अनुपात का आकलन भी डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
वर्णमिति रसायन शास्त्र के बाद 96 अच्छी तरह से थाली की एक त्वरित दृश्य निरीक्षण किया जाए या नहीं प्रक्रिया सही ढंग से प्रदर्शन किया गया था सुराग की पेशकश करेगा. पहली बात की जांच थाली की ओर प्रोफ़ाइल स्कैनिंग द्वारा प्रत्येक कुएं में तरल के स्तर है. वहाँ वास्तव में सभी कुओं में अभिकर्मकों 275 μL होना चाहिए. अगला, नेत्रहीन तीन प्रतियों नमूना कुओं के रंग का निरीक्षण और अंशांकन कुओं डुप्लिकेट. इन तकनीकी को दोहराने के नीले रंग का एक ही छाया होना चाहिए. अगले दो कुओं ग्लूकोज 6 फॉस्फेट युक्त अंशांकन वक्र लागू करने और सत्यापित करें वे कुल निकाले पी के बाद अकार्बनिक पी. के सभी 10 nmol जारी किया है ICP-OES या एक वैकल्पिक पद्धति का उपयोग करके मापा गया है, सुनिश्चित करें कि कुल पी इस का उपयोग कर परिकलित मानों प्रोटोकॉल निकाला गया था कि पी की राशि से अधिक नहीं है.
नोट: सावधान स्प्रेडशीट में डेटा प्रबंधन मात्रात्मक त्रुटियों के खिलाफ गार्ड में मदद करेगा. आप एक बार में संख्या का एक बहुत कुछ के साथ काम कर जाएगा, तो एक टेम्पलेट बनाने के अच्छी तरह से समय बिताया हो जाएगा.
चित्रा 1 एक 96 अच्छी तरह से 8 (पंक्तियों मुख्यालय) नमूने और एक अंशांकन वक्र (स्तंभों 11 और 12) के लिए परिणाम दिखाने की थाली. नियंत्रण 10 स्तंभ में हैं. रंग स्तंभों 1-3 और 4-6 के बीच तीव्रता में वृद्धि hydrolyzed monoester पी यौगिकों के कारण है, स्तंभों 4-6 और 7-9 के बीच hydrolyzed diester पी यौगिकों के कारण है.
चित्रा 2 पी कक्षाओं में 0.25 एम NaOH 0.05 वरमोंट मिट्टी नमूना उच्च throughput एंजाइमी hydrolysis का उपयोग एम EDTA निकालने का वितरण . त्रुटि सलाखों के मानक विचलन, n = 3 से संकेत मिलता है.
Discussion
अपने स्वभाव से, एक तेजी से विधि का उपयोग कर छोटे संस्करणों महान देखभाल की आवश्यकता है. इसलिए सबसे महत्वपूर्ण कदम की थाली पर pipetting समाधान को शामिल उन लोगों के हैं. सटीक, और सबसे महत्वपूर्ण बात, लगातार विंदुक तकनीक इस परख की सफलता के लिए आवश्यक हैं.
NaOH - EDTA निष्कर्षण कई नमूनों में पी के सबसे तीन वर्गों में विशेषता के लिए अनुमति देगा: orthophosphate, पी monoester diester पी. मिट्टी, खाद, अवसादों या किसी भी अन्य पर्यावरण नमूना है कि EDTA NaOH - - निष्कर्षण पी विशेषता किया जा सकता शामिल हैं . पर्यावरणीय नमूनों में पी रूपों जरूरी स्थिर नहीं कर रहे हैं और इस तकनीक के नमूनों की विशेषता रहे हैं सुनिश्चित करने के पहले नमूने शोधकर्ताओं की एक सेना को रोजगार की जरूरत के बिना समझौता कर रहे हैं.
इस परख विशेष रूप से उपयुक्त है जब नमूनों की एक बड़ी संख्या में संसाधित किया जा रहे हैं. अभिकर्मक की जरूरत है और अंतरिक्ष आवश्यकताओं एक प्रबंधनीय स्तर (जैसे 1.5 एमएल microcentrifuge बजाय ट्यूबों 50 एमएल गिलास बोतल) के लिए नीचे पहुंचा दिया गया है. यह अनुकूलन भी अपशिष्ट उत्पादन की सीमा.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम USGS और वरमोंट जल संसाधन और धन उपलब्ध कराने के लिए झील अध्ययन केंद्र धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
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