Summary
تفاصيل هذه المقالة الفيديو الإجراء التجريبي للحصول على الطاقة جيبس خالية من طي البروتين الغشاء بواسطة مضان التربتوفان.
Abstract
غشاء لطي البروتين هو موضوع الناشئة ذات الأهمية الأساسية على حد سواء والصحية ذات الصلة. وفرة للبروتينات غشاء الخلايا في ترتكز على ضرورة إجراء دراسة شاملة لهذه الأسرة القابلة للطي من البروتينات في كل مكان. بالإضافة إلى ذلك ، بدافع التقدم في قدرتنا على توصيف الأمراض المرتبطة البروتينات تتجمع جهود كبيرة التجريبي والنظري في مجال لطي البروتين. للأسف إن ما يعرقل التقدم السريع في هذا المجال المهم من التحديات الكامنة يرتبط مع بروتينات الغشاء وتعقيد آلية قابلة للطي. هنا ، ونحن المخطط إجراء التجارب لقياس الخاصية الحرارية للطاقة جيبس الحرة للتتكشف في غياب ممسخ ، غ · Δ H 2 O ، لبروتين الغشاء لا يتجزأ من ممثل E. القولونية. ويركز هذا البروتوكول على تطبيق مضان الطيفي لتحديد السكان التوازن الدول مطوية وتكشفت كدالة للتركيز ممسخ. وتبرز الاعتبارات التجريبية لإعداد حويصلات الدهون الاصطناعية وكذلك الخطوات الرئيسية في إجراء تحليل البيانات. هذا الأسلوب هو تنوعا ، ويمكن متابعتها مع أنواع مختلفة من ممسخ ، بما في ذلك درجة الحرارة ودرجة الحموضة ، وكذلك في البيئات المختلفة للطي من الدهون والمذيلات. البروتوكول الحالي هو الوحيد الذي يمكن تعميمها على أي غشاء أو البروتين للذوبان التي تلبي مجموعة من المعايير التي تناقش أدناه.
Protocol
1. إعداد الحويصلات ~ 50 نانومتر القطر Unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) للطي البروتين غشاء
- ويتم شراء محلول من 1،2 - dimyristoyl - SN - glycero - phosphocholine - 3 (DMPC) الدهون في الكلوروفورم وaliquotted في قوارير زجاجية نظيفة في 20 ملغ في كميات فيال للتخزين. إضافة طبقة من غاز النيتروجين إلى كل قارورة لمنع أكسدة الدهون ، ويتم ختم القنينات مع القبعات وparafilm. يتم تخزين قوارير في الفريزر -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ويتم استخدام قارورة واحدة تحتوي على قسامة من الدهون 20 ملغ في الكلوروفورم لكل تجربة. يتم تجفيفها محتويات القارورة باستخدام تيار من غاز النيتروجين لمدة 1 ساعة حتى لا يبقى المذيبات.
- معلق الدهون هي المجففة في 1 مل من 20 ملي البوتاسيوم العازلة الفوسفات (درجة الحموضة = 7.3) باستخدام sonicator حمام الماء ل30 ثانية ~. وهذا الحل يبدو من الدهون علقت غائم ، ويتم نقلها إلى أنبوب 15 مل من البلاستيك مع قاع مخروطي. وأضاف آخر قسامة مل 1 من العازلة الفوسفات إلى القارورة الزجاجية الفارغة التي ترد في الأصل الدهون ، ويتم تكرار صوتنة ؛ ثم يضاف إلى حل للأنبوب 15 مل نفسه. يتم تكرار هذه العملية ما مجموعه 4 مرات حتى الحجم النهائي في الأنبوب هو 4 مل ، مما أدى إلى تركيز الدهون من 5 ملغ / مل في حل هذا المخزون الحويصلة.
- يتم وضع حجم مل 4 من المادة الدهنية في حل حويصلة دافئة (~ 30 درجة مئوية) حمام المياه ، واستخدام sonicated microtip ultrasonicator لمدة 1 ساعة في دورة عمل 50 ٪. ذو شقين الغرض من حمام الماء. الأولى ، فإنه يمنع الدهون من أن يصبح حل ساخنة جدا بسبب عملية صوتنة. الثانية ، حمام دافئ يضمن درجة حرارة حل الدهن المائي لا يزال أعلى من درجة الحرارة خلال المرحلة الانتقالية طبقة ثنائية صوتنة ؛ لDMPC ، وهذا الانتقال هو درجة الحرارة 23 درجة مئوية ~
- يتم تمرير حل sonicated من خلال حقنة 0.22 ميكرون فلتر لإزالة الانقاض من طرف sonicator ، وهذا الحل هو تصفية المتوازنة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
2. تحضير عينة من أجل بسط الأولية منحنى الإسفار
- يتم حل المخزون من اليوريا 10 م في 20 ملي العازلة الفوسفات (7.3 درجة الحموضة). فمن الضروري أن يضاف الماء إلى صلب (وليس العكس) لأن كمية كبيرة من اليوريا تحتل حجما كبيرا في الحل. ويمكن إجراء هذا الحل عن طريق إضافة اليوريا المذابة إلى زجاجة نظيفة وفارغة وإضافة الماء يصل إلى حجم النهائي المقصود. قد يكون هذا الحل يتطلب ارتفاع درجات الحرارة في حمام مائي أو على طبق ساخن مع التحريك لإذابة المذاب. اليوريا هو استرطابي ، وبالتالي ، ينبغي تحديد تركيز اليوريا الفعلي للمحلول المخزون باستخدام معامل الانكسار. 1
- يتم حل المخزون الاحتياطي من الفوسفات 20 ملي (7.3 درجة الحموضة).
- تكشفت حل مخزون مستعدة البروتين. هذا الحل يجب أن يكون البروتين الأسهم تركيز البروتين ميكرومتر ~ 200 في اليوريا M 8 و 20 ملي العازلة الفوسفات.
- يتم إعداد عينات للدراسات مضان على النحو التالي. يتم تجميع كميات مناسبة من البروتين الأسهم (القسم 2.3) ، منظر حل الدهون (5 ملغ / مل الدهون ، الفرع 1) ، منظر اليوريا حل M 10 (القسم 2.1) ، والمخزون الاحتياطي الفوسفات (القسم 2.2) لجعل عينات تحتوي على ~ 4 ميكرومتر بروتين ، 1 ملغ / مل الدهون ، و0-8 اليوريا M بزيادات M 1. إجمالي حجم العينة هو 200 لكل ميكرولتر. يتم تضمين جدول المثال (الجدول 1) الذي يسرد وحدات التخزين المطلوبة باستخدام مخزون 200 ميكرومتر حل البروتين.
- مصنوعة عينات فارغة كما هو موضح في القسم 2.4 ، ومع ذلك ، لا يتم إضافة البروتين. في مكان من البروتين ، يمكن إضافة 4 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 م حتى تركيزات المكونات الأخرى مماثلة لتلك الموجودة في القسم 2.4. وتستخدم هذه الفراغات للطرح نثر وغيرها من إشارة الخلفية التي تظهر في أطياف مضان من البروتين.
- ويسمح للعينات من المقاطع 2.4 و 2.5 لاحتضان على 37 درجة مئوية على الأقل 2 ساعة قبل قياس أطياف مضان لضمان موازنة كاملة وقابلة للطي.
3. قياس الأطياف الإسفار
يقاس التربتوفان مضان من كل عينة فارغة وباستخدام مقياس التألق المستمر للدولة. يجب أن تسجل أطياف مضان مع الطول الموجي من 290 نانومتر الإثارة لتجنب الإثارة مخلفات التيروزين ، وتفحص 305-500 نانومتر. مدخل ممر الموجة نموذجية والخروج هو 3 نانومتر. يمكن أن يكون الأمثل لزيادة الطول الموجي والوقت التكامل للإشارة إلى نسبة الضوضاء. القيم النموذجية لزيادة الطول الموجي والوقت والتكامل 1 نانومتر / خطوة و 0.5 ثانية / الخطوة ، على التوالي. الغشاء أضعاف البروتينات عموما في الدهون الاصطناعية فقط عندما تكون درجة الحرارة أعلى من درجة حرارة طبقة ثنائية المرحلة الانتقالية. ولذلك ، في هذه الحالة من DMPC ، هو عقد درجة حرارة ثابتة عند 30 عينة درجة مئوية. وتستخدم وكفيت microvolume السيليكا تنصهر مع 160 ميكرولتر القدرات في هذه السابقينperiments.
4. جيل الأولية منحنى بسط وتقدير للطاقة جيبس الحرة للبروتين الغشاء بسط
- يتم تحميل أطياف مضان في شكل مجموعة البيانات XY في صناعة البرمجيات مثل ايغور برو ، ماتلاب ، المنشأ ، أو Excel.
- يجب أن تطرح الإشارة من الخلفية حويصلة اليوريا والدهون باستخدام الإجراء التالي :
A = الطيف الطيف مضان من البروتين الخام في حضور حويصلات الدهنية وتركيز محدد من اليوريا.
B = الطيف الطيف مضان الخام من عينة فارغة المطابقة التي تحتوي على الدهون والحويصلات نفس تركيز اليوريا كما أنه في الطيف ، ولا البروتين في عينات فارغة.
الطيف الطيف تصحيح = A -- C * طيف B. C هو المساواة العددية عادة إلى 1.0. في بعض الحالات ، C أقل من أو أكبر من 1.0 لأن القضايا التي تسبب أكثر من نثر أو تحت الطرح بالقرب من المنطقة 305-320 نانومتر ~. - وجدولتها الطول الموجي للمضان الأقصى ، λ كحد أقصى ، من أطياف تصحيح لكل تركيز اليوريا. كشف قيمة نموذجية للبروتين الكامل هو 350 نانومتر الغشاء في حين أن البروتين هو مطوية ~ 330 نانومتر. يتم تحويل موجات جدولتها لكسر تكشفت من خلال تحويل مجموعة من القيم أقصى λ (~ 330 إلى 350 نانومتر ~) لمجموعة 0،0-1،0 لربط قيمة الحد الأقصى لλ جزء من السكان تكشفت. على سبيل المثال ، قيمة الحد الأقصى من 330 نانومتر λ يناظر 0،0 ، و 350 نانومتر يناظر 1.0 ، و 340 نانومتر إلى 0.5 يتوافق من حيث نسبة تكشفت. ثم يتم رسم جزء من هذا البروتين تكشفت ضد تركيز اليوريا. كما ذكر أعلاه ، ينبغي تحديد تركيز اليوريا تجريبيا من خلال قياس معامل الانكسار.
- نحن نفترض أن البروتين لا يمكن أن توجد في واحدة من دولتين : مطوية أو كشف. كشف مؤامرة من كسر ، و ، في مقابل تركيز يمكن احتواء اليوريا ، C ، للمعادلة : 2
م في معامل يتوافق مع معدل التغير في الطاقة الحرة فيما يتعلق بتركيز ممسخ وجيم متر يتوافق مع تركيز اليوريا في منتصف الطريق الذي مطوية السكان يساوي عدد سكان تكشفت. هذه القيم هي المتغيرات التي تم الحصول عليها من تركيب المربعات الصغرى المناسب بواسطة برنامج تحليل البيانات. R (0.001987 كيلو كالوري / مول • K) هو قانون ثابت الغاز ، و T هي درجة الحرارة (303 K). - وتستخدم في معاملات الحصول عليها من يصلح لتحديد الخطوط جيبس الطاقة (كيلو كالوري / مول) لتتكشف في غياب اليوريا :
.
. 5. الأمثل بسط Curve للقياس أدق للطاقة جيبس الحرة تتكشف.
- منحنى تتكشف المذكورة أعلاه تكشف عن مجموعة من تركيزات اليوريا الذي يتسبب في أكبر تغيير في أقصى λ. هذا النطاق هو عادة صغيرة ، وغالبية تتكشف يحدث داخل هذه الطائفة الصغيرة. على وجه التحديد من أجل تحديد الطاقة خالية من تتكشف ، ويتم تحليل العينات إضافية في هذه المنطقة للحصول على قطعة يحتوي على العديد من نقاط البيانات اللازمة لتركيب المربعات الصغرى الأمثل. على سبيل المثال ، إذا كان البروتين تتكشف بين 2 و 4 M اليوريا ، يمكن إجراء العينات التي تحتوي على 2-4 M اليوريا بزيادات M 0.2 إلى أدق تكشف عن شكل هذه المنطقة الهامة في منحنى تتكشف. ليس من الضروري لقياس أطياف فارغة في كل تركيز اليوريا ، بل يكفي لقياس الطيف فارغة كل خطوة ~ M 0.5.
- قد تتكشف للطاقة خالية من الحصول عليها من هذه المؤامرة تختلف قليلا عن تلك التي حصلت في منحنى الأصلي تتكشف ، ولكنه يعكس قيمة أكثر دقة.
6. ممثل النتائج :
| عينة | نهائي [اليوريا] ، M | بروتين الأسهم (ميكرولتر) | المخزون الدهني (ميكرولتر) | الأسهم 10 M اليوريا (ميكرولتر) | المخزون الاحتياطي (ميكرولتر) |
| 1 | ~ 0.16 | 4 | 40 | 0 | 156 |
| 2 | 1 | 4 | 40 | 20 | 136 |
| 3 | 2 | 4 | 40 | 40 | 116 |
| 4 | 3 | 4 | 40 | 60 | 96 |
| 5 | 4 | 4 | 40 | 80 | 76 |
| 6 | 5 | 4 | 40 | 100 | 56 |
| 7 | 6 | 4 | 40 | 120 | 36 |
| 8 | 7 | 4 | 40 | 140 | 16 |
الجدول 1. حجم المخزون من الحلول المطلوبة لجعل عينات مضان
الشكل 1. تريبتوفان مضان أطياف من البروتين 5 ميكرومتر ~ ممثل الغشاء الذي يحتوي على بقايا التربتوفان واحد. (A) أطياف مضان من البروتين الخام (A الطيف من 4.2) ، (B) أطياف مضان الخام من فارغة (B الطيف من 4.2) ، (C) التي تم تصحيحها من 4.2 الطيف.
تصحيح الرقم 2. التربتوفان مضان أطياف من البروتين غشاء من الشكل رقم 1 لتركيزات اليوريا عديدة.
الشكل 3. بسط منحنى تم الحصول عليها من البيانات في الشكل 2 ، مع أن من المناسب في المعادلة 4.4. يتم حساب الطاقة الحرة جيبس فقا للمادة 4.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول الحالي يصف جيل من المنحنيات التي تتكشف للغشاء المرتبطة البروتينات والببتيدات التي تحتوي على بقايا التربتوفان. هنا ، يفترض أن مضان التربتوفان يعكس ما إذا كان يتم طي البروتين والدهون إدراجها في الحويصلات الاصطناعية ، أو كشف في الحل. يتم إجراء افتراضات إضافية ، مثل الدولتين للطي والاعتماد الخطي للطاقة الحرة مع تركيز ممسخ ، في التقرير الحالي ، ويمكن بسهولة تعديل هذه النتيجة الافتراضات في معادلات مختلفة (2) بروتوكول التجريبية يمكن تعديلها لتستخدم observables الطيفية مختلفة ، مثل كما ازدواج اللون دائرية ، والاستيعاب ، أو مضان من صبغ خارجي (3) ، وكذلك هلام إستشراد 4 بالإضافة إلى ذلك ، denaturants مختلفة ، مثل guanidinium ، المحاليل الحمضية ، أو درجة الحرارة ، وكذلك الدهون البديلة / الحويصلات ، مثل الدهون أنيوني واسعة ويمكن استخدام unilamellar الحويصلات ، أو المذيلات. 5،6 وأخيرا ، يمكن تطبيق البروتوكول على أي بروتين الغشاء ، الببتيد الأغشية المرتبطة بها ، وقابل للذوبان البروتين الببتيد / تلبي معايير قابلة للطي عكسها ، والمعارض أن الطيفية أو غيرها ملاحظة علامة بتكوين جزئي للدول المختلفة. في حالة من البروتينات القابلة للذوبان ، وحذفت من الواضح الحويصلات من البروتوكول.
جيبس الطاقة خالية من تتكشف رؤية ثاقبة للتفاعلات التي noncovalent استقرار الجزيئات الحيوية. في المختبر لدينا ، لقد قمنا بقياس تتكشف عن منحنيات المسوخ من بروتين الغشاء الخارجي (OmpA) التي تحتوي على بقايا التربتوفان واحد في مواقع مختلفة ، وذكرت أنه تم زعزعت المسوخ النسبية للبروتين من النوع البري الذي يحتوي على خمس بقايا التربتوفان الأصلي. 7 وتستكمل هذه الدراسات التي تتكشف من خلال تقنيات أخرى ، بما في ذلك التحليل الطيفي الذبذبات ، لتوضيح تفاصيل الجزيئي ، على سبيل المثال ، الروابط الهيدروجينية والتفاعلات البشرى التي تكمن وراء الاختلاف في الاستقرار. باختصار ، يمكن تطبيق هذه التقنية بسيطة نسبيا من المنحنيات التي تتكشف لغشاء بروتينات قابلة للذوبان والكشف عن الديناميكا الحرارية المرتبطة لطي البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر وو بكين لاستخدام بيانات لها. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة التوظيف لجبهة الخلاص الوطني JEK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| Urea | MP Biomedicals | 04821527 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P288 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285 |
References
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).
- Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
- Booth, P. J., Curnow, P. Folding scene investigation: membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
- Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).
- Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).
