Denna video artikeln närmare den experimentella förfarande för erhållande av Gibbs fria energi av membran protein folding av tryptofan fluorescens.
Abstract
Membran protein folding är ett framväxande ämne med både grundläggande och hälsorelaterade betydelse. Överflödet av membranproteiner i celler ligger bakom behovet av omfattande studie av vikning av denna allestädes närvarande familj av proteiner. Dessutom har framsteg i vår förmåga att karakterisera sjukdomar som förknippas med felveckade proteiner motiverade betydande experimentella och teoretiska insatser inom området proteinveckning. Snabba framsteg inom detta viktiga område är tyvärr hindras av den inneboende utmaningar som är förknippade med membranproteiner och komplexitet hopfällningsmekanism. Vi presenterar här en experimentell metoder för att mäta termodynamiska egendom Gibbs fria energi utvecklas i frånvaro av denatureringsmedel, Δ g · H 2 O, för ett representativt integrerad membranprotein från E. coli. Detta protokoll är inriktat på tillämpningen av fluorescens spektroskopi för att bestämma balansen populationer av vikt och ovikt stater som funktion av denatureringsmedel koncentration. Experimentella överväganden för beredning av syntetiska lipid blåsor samt viktiga steg i dataanalysen förfarandet är markerade. Denna teknik är mångsidig och kan bedrivas med olika typer av denatureringsmedel, bland annat temperatur och pH, samt i olika vikning miljöer av lipider och miceller. Det nuvarande protokollet är en som kan generaliseras till alla membran eller lösligt protein som uppfyller kriterier som diskuteras nedan.
Protocol
1. Beredning av ~ 50 små nm diameter Unilamellar Blåsor (SUV) för Membrane Protein Folding En lösning av 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) lipider i kloroform köps och aliquotted i rena glasflaskor på 20 mg per injektionsflaska kvantiteter för förvaring. Ett lager av kvävgas tillsätts i varje flaska för att förhindra lipid oxidation, och flaskorna är förseglade med lock och parafilm. Injektionsflaskorna förvarats i en -20 ° C frys fram till användning. En i…
Discussion
Den nuvarande protokollet beskriver generationen utspelas kurvor av membran-associerade proteiner och peptider som innehåller tryptofan rester. Här är det antas att tryptofan fluorescens reflekterar om proteinet är vikt och infogas i syntetiska lipid blåsor eller ovikta i lösning. Ytterligare antaganden, till exempel två-state-vikning och linjärt beroende av fri energi med denatureringsmedel koncentration, görs i den aktuella rapporten,. Ändring av dessa antaganden resulterar i olika ekvationer 2 De…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Peking Wu för användning av hennes uppgifter. Detta arbete stöddes av en NSF KARRIÄR pris till jek
Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy. J. Vis. Exp. (50), e2669, doi:10.3791/2669 (2011).