تفاصيل هذه المقالة الفيديو الإجراء التجريبي للحصول على الطاقة جيبس خالية من طي البروتين الغشاء بواسطة مضان التربتوفان.
Abstract
غشاء لطي البروتين هو موضوع الناشئة ذات الأهمية الأساسية على حد سواء والصحية ذات الصلة. وفرة للبروتينات غشاء الخلايا في ترتكز على ضرورة إجراء دراسة شاملة لهذه الأسرة القابلة للطي من البروتينات في كل مكان. بالإضافة إلى ذلك ، بدافع التقدم في قدرتنا على توصيف الأمراض المرتبطة البروتينات تتجمع جهود كبيرة التجريبي والنظري في مجال لطي البروتين. للأسف إن ما يعرقل التقدم السريع في هذا المجال المهم من التحديات الكامنة يرتبط مع بروتينات الغشاء وتعقيد آلية قابلة للطي. هنا ، ونحن المخطط إجراء التجارب لقياس الخاصية الحرارية للطاقة جيبس الحرة للتتكشف في غياب ممسخ ، غ · Δ H 2 O ، لبروتين الغشاء لا يتجزأ من ممثل E. القولونية. ويركز هذا البروتوكول على تطبيق مضان الطيفي لتحديد السكان التوازن الدول مطوية وتكشفت كدالة للتركيز ممسخ. وتبرز الاعتبارات التجريبية لإعداد حويصلات الدهون الاصطناعية وكذلك الخطوات الرئيسية في إجراء تحليل البيانات. هذا الأسلوب هو تنوعا ، ويمكن متابعتها مع أنواع مختلفة من ممسخ ، بما في ذلك درجة الحرارة ودرجة الحموضة ، وكذلك في البيئات المختلفة للطي من الدهون والمذيلات. البروتوكول الحالي هو الوحيد الذي يمكن تعميمها على أي غشاء أو البروتين للذوبان التي تلبي مجموعة من المعايير التي تناقش أدناه.
Protocol
1. إعداد الحويصلات ~ 50 نانومتر القطر Unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) للطي البروتين غشاء ويتم شراء محلول من 1،2 – dimyristoyl – SN – glycero – phosphocholine – 3 (DMPC) الدهون في الكلوروفورم وaliquotted في قوارير زجاجية نظيفة في 20 ملغ في كمي…
Discussion
البروتوكول الحالي يصف جيل من المنحنيات التي تتكشف للغشاء المرتبطة البروتينات والببتيدات التي تحتوي على بقايا التربتوفان. هنا ، يفترض أن مضان التربتوفان يعكس ما إذا كان يتم طي البروتين والدهون إدراجها في الحويصلات الاصطناعية ، أو كشف في الحل. يتم إجراء افتراضات إضاف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر وو بكين لاستخدام بيانات لها. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة التوظيف لجبهة الخلاص الوطني JEK
Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy. J. Vis. Exp. (50), e2669, doi:10.3791/2669 (2011).