Summary
Deze video artikel beschrijft de experimentele procedure voor het verkrijgen van de Gibbs vrije energie van membraaneiwit vouwen door tryptofaan fluorescentie.
Abstract
Membraaneiwit vouwen is een opkomende onderwerp met zowel fundamenteel en gezondheid-gerelateerde betekenis. De overvloed van membraaneiwitten in cellen ligt ten grondslag aan de noodzaak van een omvattende studie van de vouwen van deze alomtegenwoordige familie van eiwitten. Daarnaast hebben ontwikkelingen in ons vermogen om ziekten die samenhangen met verkeerd gevouwen eiwitten te karakteriseren gemotiveerd belangrijke experimentele en theoretische inspanningen op het gebied van eiwitten vouwen. Snelle vooruitgang op dit belangrijke gebied is helaas gehinderd door de inherente uitdagingen in verband met membraaneiwitten en de complexiteit van het klapmechanisme. Hier schetsen we een experimentele procedure voor het meten van de thermodynamische eigenschap van de Gibbs vrije energie van ontvouwing in de afwezigheid van denaturerende, Δ G ° H 2 O, voor een representatieve integrale membraaneiwit van E. coli. Dit protocol richt zich op de toepassing van fluorescentie spectroscopie te bepalen evenwicht populaties van in-en uitklapbaar staten als een functie van de denatureringsmiddel concentratie. Experimentele overwegingen voor de bereiding van synthetische lipide vesicles, alsook de belangrijkste stappen in de data-analyse procedure worden gemarkeerd. Deze techniek is veelzijdig en kan worden nagestreefd met verschillende typen denatureringsmiddel, zoals temperatuur en pH, maar ook in diverse omgevingen vouwen van lipiden en micellen. Het huidige protocol is er een die kan worden gegeneraliseerd naar een membraan of oplosbaar eiwit dat de set van criteria die hieronder besproken voldoet.
Protocol
1. De voorbereiding van ~ 50 nm diameter Kleine unilamellaire Blaasjes (SUV's) voor het membraaneiwit Folding
- Een oplossing van 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) lipiden in chloroform is gekocht en aliquotted in schone glazen flacons in 20 mg per flacon hoeveelheden voor opslag. Een laag van stikstof gas wordt toegevoegd aan elke flacon om lipide oxidatie te voorkomen, en de flesjes worden afgesloten met caps en parafilm. De flacons worden opgeslagen in een -20 ° C vriezer tot gebruik.
- Een enkele flacon die een hoeveelheid van 20 mg lipiden in chloroform bevat wordt gebruikt voor elk experiment. De inhoud van de flacon worden gedroogd met behulp van een stroom van stikstofgas gedurende 1 uur totdat er geen oplosmiddelen blijft.
- Gedroogde lipiden zijn geresuspendeerd in 1 ml van 20 mM kaliumfosfaatbuffer (pH = 7,3) met behulp van een waterbad ultrasoonapparaat voor ~ 30 seconden. Deze oplossing van de geschorste lipide zal verschijnen bewolkt, en is overgebracht naar een plastic 15-mL buis met een conische bodem. Een ander 1 ml van fosfaat buffer wordt toegevoegd aan de lege glazen flesje, dat oorspronkelijk lipide, en sonicatie wordt herhaald, de oplossing wordt dan toegevoegd aan dezelfde 15-mL buis. Dit proces wordt herhaald in totaal 4 keer tot het uiteindelijke volume in de buis is 4 mL, wat resulteert in een lipide concentratie van 5 mg / ml in dit bestand vesicle oplossing.
- De 4 ml volume van de lipide bolletjes oplossing is geplaatst in een warm (~ 30 ° C) waterbad, en gesoniceerd met behulp van een ultrasonicator microtip gedurende 1 uur bij 50% inschakelduur. Het doel van het waterbad is tweeledig. Ten eerste zorgt het ervoor dat de lipide-oplossing te heet worden vanwege de ultrasoonapparaat proces. Ten tweede, de warm bad zorgt ervoor dat de temperatuur van de waterige oplossing lipide blijft boven de bilaag fase-overgang temperatuur tijdens sonicatie, want DMPC, deze overgang temperatuur is ~ 23 ° C.
- De gesoniceerde oplossing wordt door een 0,22 urn spuitfilter om vuil te verwijderen uit de ultrasoonapparaat tip, en dit gefilterde oplossing is evenwicht 's nachts bij 37 ° C.
2. Monstervoorbereiding voor Initial Fluorescentie Unfolding Curve
- Een voorraad oplossing van 10 M ureum in 20 mM fosfaatbuffer (pH 7,3) wordt gemaakt. Het is essentieel dat het water worden toegevoegd aan de vaste (en niet vice versa), omdat de grote hoeveelheid ureum neemt een aanzienlijk volume in de oplossing. Dit ureum oplossing kan worden gemaakt door toevoeging van opgeloste stoffen naar een schone, lege fles en het toevoegen van water tot aan de beoogde uiteindelijke volume. Deze oplossing kan verlangen opwarming in een waterbad of op een hete plaat, al roerend aan de opgeloste stof te ontbinden. Ureum is hygroscopisch en daarom de feitelijke concentratie van de ureum-stockoplossing moet worden bepaald met behulp brekingsindex 1.
- Een voorraad bufferoplossing van 20 mM fosfaat (pH 7,3) wordt gemaakt.
- Een voorraad oplossing van ontvouwen eiwitten is voorbereid. Deze voorraad eiwitoplossing moet een concentratie van ~ 200 uM eiwit in 8 M ureum, 20 mM fosfaatbuffer.
- Monsters voor fluorescentie studies worden voorbereid op de volgende manier. Voldoende hoeveelheden op voorraad eiwit (paragraaf 2.3), voorraad lipide-oplossing (5 mg / ml lipide, hoofdstuk 1), voorraad 10 M ureum-oplossing (paragraaf 2.1), en de voorraad fosfaat buffer (paragraaf 2.2) worden gecombineerd om monsters met ~ 4 maken uM eiwit, 1 mg / ml lipide, en 0 tot 8 M ureum in 1 M stappen. Het totale volume van elk monster is 200 pi. Een voorbeeld spreadsheet (tabel 1) is opgenomen dat de lijsten volumes nodig met behulp van een 200 uM voorraad eiwit-oplossing.
- Blanco monsters worden gemaakt zoals beschreven in paragraaf 2.4, is echter eiwit niet toegevoegd. In plaats van eiwit, 4 mei ul van een 8 M ureum-oplossing worden toegevoegd, zodat de concentratie van andere componenten zijn identiek aan die in paragraaf 2.4. Deze blanks worden gebruikt om verstrooiing en andere achtergrond signaal dat verschijnt in de fluorescentie spectra van eiwitten af te trekken.
- Monsters van punten 2.4 en 2.5 mogen bij 37 ° C incuberen gedurende ten minste 2 uur vóór de meting van de fluorescentie spectra te voltooien vouwen en evenwicht te verzekeren.
3. Meting van Fluorescentie Spectra
Tryptofaan fluorescentie van elk monster en blanco is gemeten met behulp van een steady-state fluorometer. Fluorescentie spectra te worden geregistreerd met excitatie golflengte van 290 nm tot excitatie van tyrosine residuen te voorkomen, en gescand 305 tot 500 nm. Typische in-en uitgang bandpass is 3 nm. De golflengte verhogen en de integratie tijd kan worden geoptimaliseerd voor signaal-ruisverhouding. Typische waarden voor golflengte verhogen en de integratie tijd 1 nm / stap en 0,5 sec / stap, respectievelijk. Membraaneiwitten algemeen vouwen in synthetische lipiden alleen wanneer de temperatuur boven de bilaag fase-overgang temperatuur. Daarom is in dit geval van DMPC, is de temperatuur van het monster constant gehouden bij 30 ° C. Een microvolume kwartsglas cuvet met 160 pi capaciteit wordt benut in deze exexperimenten.
4. Generatie van Initial uitvouwen Curve en de schatting van Gibbs vrije energie van membraaneiwit Unfolding
- Fluorescentie spectra in de vorm van een xy dataset worden geladen in software zoals Igor Pro, Matlab, Origin of Excel.
- Signaal van de ureum en lipide bolletjes achtergrond moet worden afgetrokken met behulp van de volgende procedure:
Spectrum A = rauwe fluorescentie spectrum van eiwitten in de aanwezigheid van lipide vesicles en de specifieke concentratie van ureum.
Spectrum B = rauwe fluorescentie spectrum van de overeenkomstige blanco monster dat lipide blaasjes en dezelfde concentratie ureum bevat als die in spectrum A, geen eiwit is in de blanco monsters.
Gecorrigeerde Spectrum Spectrum = A - C * spectrum B. C is een scalaire meestal gelijk aan 1,0. In sommige gevallen, C is minder dan of groter is dan 1,0 als gevolg van verstrooiing zaken die leiden tot over-of onder-aftrekken bij de ~ 305-320 nm. - De golflengte van de maximale fluorescentie, λ max, is een tabel van de spectra gecorrigeerd voor elke ureum concentratie. Een typische waarde voor volledig ontvouwen membraaneiwit is 350 nm, terwijl die van gevouwen eiwit is ~ 330 nm. Tabel golflengten worden omgezet fractie ontvouwen door het omzetten van het bereik van de λ max-waarden (~ 330 tot ~ 350 nm) om het bereik 0,0 tot 1,0 op de λ maximale waarde correleren met fractie van ontvouwen bevolking. Bijvoorbeeld, een λ max waarde van 330 nm komt overeen met 0,0, 350 nm komt overeen met 1,0 en 340 nm komt overeen met 0,5 in termen van fractie ontvouwde. Deze fractie van ontvouwen eiwitten wordt vervolgens uitgezet tegen de concentratie ureum. Zoals hierboven vermeld, moet de ureumconcentratie experimenteel worden bepaald door het meten van de brekingsindex.
- We nemen aan dat het eiwit kan bestaan in een van de twee staten: gevouwen of ongevouwen. De plot van fractie ontvouwde zich, f, versus ureumconcentratie, C, kan worden geschikt om de vergelijking: 2
De coëfficiënt m komt overeen met de mate van verandering van de vrije energie met betrekking tot denatureringsmiddel concentratie, en C m komt overeen met het midden ureum concentratie waarbij de gevouwen bevolking is gelijk aan het ontvouwen bevolking. Deze waarden zijn de fitting variabelen verkregen uit kleinste-kwadraten fitting door de data-analyse software. R (0.001987 kcal / mol • K) is het gas constante van de wet, en T is de temperatuur (303 K). - De coëfficiënten verkregen uit de fit worden gebruikt om de Gibbs vrije energie (kcal / mol) van ontvouwing in de afwezigheid van ureum te bepalen:
.
. 5. Geoptimaliseerd Unfolding Curve voor meer precieze meting van de Gibbs vrije energie van ontvouwen.
- Het zich ontvouwende curve hierboven beschreven onthult het bereik van de ureum concentraties dat de grootste verandering in de λ max veroorzaakt. Dit assortiment is meestal klein, en de meerderheid van ontvouwen zich voordoet binnen dit kleine bereik. Om precies de vrije energie van ontvouwen te bepalen, worden bijkomende monsters geanalyseerd in deze regio om een plot dat veel datapunten die noodzakelijk zijn voor optimale kleinste-kwadraten fitting bevat te verkrijgen. Bijvoorbeeld, als het eiwit speelt zich af tussen 2 en 4 M ureum, kunnen monsters worden gemaakt die bevatten 2 - 4 m ureum in 0,2 M stappen om nauwkeuriger te onthullen de vorm van deze belangrijke regio in de zich ontvouwende curve. Het is niet nodig om lege spectra te meten bij elke ureumconcentratie, het is voldoende om een lege spectrum te meten elke ~ 0.5 M stap.
- De vrije energie van ontvouwen verkregen uit deze complot kunnen iets afwijken van die verkregen bij de oorspronkelijke curve ontvouwen, maar weerspiegelt een meer precieze waarde.
6. Representatieve resultaten:
| Monster | definitief [Ureum], M | voorraad eiwit (pi) | voorraad lipide (pi) | voorraad 10 M ureum (pi) | voorraad buffer (pi) |
| 1 | ~ 0,16 | 4 | 40 | 0 | 156 |
| 2 | 1 | 4 | 40 | 20 | 136 |
| 3 | 2 | 4 | 40 | 40 | 116 |
| 4 | 3 | 4 | 40 | 60 | 96 |
| 5 | 4 | 4 | 40 | 80 | 76 |
| 6 | 5 | 4 | 40 | 100 | 56 |
| 7 | 6 | 4 | 40 | 120 | 36 |
| 8 | 7 | 4 | 40 | 140 | 16 |
Tabel 1. Volume op voorraad oplossingen die nodig zijn om de fluorescentie monsters te maken
Figuur 1. Tryptofaan fluorescentie spectra van ~ 5 uM vertegenwoordiger membraaneiwit dat een tryptofaan residu bevat. (A) Raw fluorescentie spectra van eiwit (spectrum A van 4,2), (B) Raw fluorescentie spectra van blanco (spectrum B van 4,2), (C) gerectificeerd spectrum van 4,2.
Figuur 2. Gecorrigeerd tryptofaan fluorescentie spectra van membraaneiwit uit figuur 1 voor tal van ureum concentraties.
Figuur 3. Unfolding curve verkregen uit gegevens in figuur 2, met geschikt om vergelijking in 4.4. De Gibbs vrije energie is berekend volgens punt 4.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft de generatie van ontvouwen curves van membraan-geassocieerde eiwitten en peptiden die tryptofaan residuen bevatten. Hier wordt ervan uitgegaan dat de tryptofaan fluorescentie weerspiegelt de vraag of het eiwit is gevouwen en ingevoegd in synthetisch lipide vesicles, of ongevouwen in oplossing. Aanvullende hypothesen, zoals de twee-staten-vouwen en lineaire afhankelijkheid van de vrije energie met denaturant concentratie, worden gemaakt in het huidige verslag;. Wijziging van deze aannames leiden tot verschillende vergelijkingen 2 Het experimentele protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende spectroscopische waarnemingen te gebruiken, zoals als circulair dichroïsme, absorptie of fluorescentie van een extrinsieke kleurstof, 3, alsmede gelelektroforese. 4 Bovendien, verschillende denatureringsmiddelen, zoals guanidinium, zure oplossingen, of temperatuur, evenals alternatieve lipiden / blaasjes, zoals anionische lipiden, grote unilamellaire blaasjes, of micellen, kunnen worden gebruikt. 5,6 tot slot, het protocol kan worden toegepast op elk membraan eiwit, membraan-geassocieerde peptide, en oplosbare eiwit / peptide dat aan de criteria van een reversibele vouwen voldoet, en dat vertoont een spectroscopische of andere waarneembare marker voor verschillende conformationele toestanden. In het geval van oplosbare eiwitten, zijn blaasjes uiteraard weggelaten uit het protocol.
Gibbs vrije energie van ontplooien geeft inzicht in de niet-covalente interacties die biomoleculen te stabiliseren. In ons lab hebben we gemeten ontvouwen curves voor mutanten van de buitenste membraan Proteïne A (OmpA) die enkele tryptofaan residuen op verschillende locaties bevatten, en meldde dat de mutanten werden ten opzichte van gedestabiliseerd om de wild-type eiwit dat vijf autochtone tryptofaan residu's bevat. 7 Deze ontvouwen studies worden aangevuld met andere technieken, waaronder vibrationele spectroscopie, om moleculaire details van, bijvoorbeeld, waterstofbruggen en paarsgewijze interacties die de variatie ten grondslag liggen aan de stabiliteit toe te lichten. Samengevat, kan de relatief eenvoudige techniek van het zich ontvouwende bochten worden toegepast op membraan en oplosbare eiwitten aan thermodynamica geassocieerd met het vouwen van eiwitten zichtbaar te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Beijing Wu voor het gebruik van haar gegevens. Dit werk werd ondersteund door een NSF LOOPBAAN award aan Jek
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850345C | |
| Urea | MP Biomedicals | 04821527 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P288 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285 |
References
- Shirley, B. A. Protein Folding and Stability. Shirley, B. A. , Humana Press. 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).
- Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
- Booth, P. J., Curnow, P. Folding scene investigation: membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
- Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).
- Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).
