Questo articolo dettagli video la procedura sperimentale per ottenere l'energia libera di Gibbs di ripiegamento delle proteine della membrana da triptofano fluorescenza.
Abstract
Ripiegamento delle proteine della membrana è un tema emergente di significati fondamentali e relativi alla salute. L'abbondanza di proteine di membrana delle cellule in base alla necessità per lo studio completo della piegatura di questa famiglia ubiquitaria di proteine. Inoltre, i progressi nella capacità di caratterizzare malattie associate con le proteine mal ripiegate hanno motivato notevoli sforzi teorici e sperimentali nel campo del ripiegamento delle proteine. Rapidi progressi in questo importante settore è purtroppo ostacolata dalle sfide inerenti associate proteine di membrana e la complessità del meccanismo di ripiegamento. Qui, delineare una procedura sperimentale per la misura di proprietà termodinamiche di energia libera di Gibbs di dispiegarsi in assenza di denaturante, Δ G ° H 2 O, per una proteina di membrana integrale rappresentante da E. coli. Questo protocollo si concentra sull'applicazione della spettroscopia di fluorescenza per determinare l'equilibrio le popolazioni degli stati piegato e spiegato in funzione della concentrazione di denaturante. Considerazioni sperimentali per la preparazione di vescicole lipidiche sintetici, nonché alle fasi principali della procedura di analisi dei dati sono evidenziati. Questa tecnica è versatile e può essere perseguito con diversi tipi di denaturante, tra cui la temperatura e pH, così come in vari ambienti ripiegamento dei lipidi e delle micelle. Il protocollo attuale è quella che può essere generalizzato a qualsiasi membrana o proteina solubile che soddisfa l'insieme dei criteri discussi di seguito.
Protocol
1. Preparazione di ~ 50 nm Diametro piccole vescicole unilamellari (SUV) per Folding delle proteine di membrana Una soluzione di 1,2-dimyristoyl-sn-glicero-3-phosphocholine (DMPC) lipidi in cloroformio viene acquistato e aliquotted in fiale di vetro pulita in quantità di 20 mg per fiala per la conservazione. Uno strato di gas azoto viene aggiunto a ogni fiala per prevenire l'ossidazione dei lipidi, e le fiale sono chiusi con tappi e parafilm. I flaconcini sono conservati in un congelatore …
Discussion
L'attuale protocollo descrive la generazione di curve di svolgimento associata alla membrana proteine e peptidi che contengono residui di triptofano. Qui, si presume che la fluorescenza triptofano riflette se la proteina viene piegato e inserito in vescicole lipidiche sintetico, o si è svolto in soluzione. Ipotesi aggiuntive, come due Stati piegatura e dipendenza lineare di energia libera con concentrazione denaturante, sono contenute nella relazione corrente;. Modifica di tali presupposti risultato in divers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Wu Pechino per l'utilizzo dei suoi dati. Questo lavoro è stato supportato da un riconoscimento alla CARRIERA NSF a JEK
Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy. J. Vis. Exp. (50), e2669, doi:10.3791/2669 (2011).