Summary
نحن يبرهن على وجود مناعي لونين (CHIP) طريقة لتحديد التفاعلات عامل في جينات محددة الأنسجة أثناء أو بعد ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني في الأنسجة الجنينية الماوس. هذا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع بروتوكول لدراسة تفعيل الجين الأنسجة محددة كما يحدث أثناء التطور الجنيني الطبيعي.
Abstract
الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة قوية لتحديد البروتين : التفاعلات التي تحدث لونين في سياق الخلايا الحية 1-3. وقد تم استغلال هذه التقنية على نطاق واسع في خلايا الأنسجة ، وإلى حد أقل ، في النسيج الأساسي. معقد تطبيق الشذرة في الأنسجة الجنينية القوارض ، وخصوصا في أوقات مبكرة من التنمية ، من كمية محدودة من الأنسجة والخلايا وعدم تجانس أنواع الأنسجة في الجنين. هنا نقدم وسيلة لتنفيذ الشذرة به يوميا نأت الجنينية 8.5 (E8.5) الجنين. ويمكن تقسيم المنفصمة لونين من جنين واحد إلى E8.5 تصل إلى خمس aliquots ، والذي يسمح للمحقق مادة كافية لعناصر والتحقيق للبروتين معين : التفاعلات لونين.
وقد استخدمت هذه التقنية لأننا نبدأ في الوثيقة البروتين : التفاعلات ونين خلال مواصفات الأنسجة برامج محددة التعبير الجيني. عدم تجانس أنواع الخلايا في الجنين يقيد بالضرورة تطبيق هذا الأسلوب لأن النتيجة هي الكشف عن البروتين : التفاعلات ونين دون تمييز ما إذا كانت التفاعلات تحدث في كل شيء ، مجموعة فرعية من ، أو نوع خلية واحدة (ق). ومع ذلك ، وفحص الأنسجة محددة الجينات أثناء أو في أعقاب ظهور الأنسجة محددة التعبير الجيني هو ممكن لسببين. أولا ، مناعي من العوامل المحددة الأنسجة المعزولة بالضرورة لونين من نوع الخلية حيث يتم التعبير عن عامل. الثانية ، لا ينبغي للمناعي coactivators histones والتي تحتوي على بعد متعدية التعديلات التي ترتبط مع تنشيط الجينات يمكن العثور على الجينات وتسلسل الجينات التنظيمية في نوع من الخلايا الجينات حيث يجري أو قد تم تفعيلها. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق تقنية لدراسة معظم أنسجة محددة الأحداث التنشيط الجيني.
نحن المستخدمة في المثال المبين أدناه ، وE8.5 E9.5 أجنة الفئران لدراسة عامل ملزم في جين معين المروج العضلات والهيكل العظمي. Somites ، وهي الأنسجة التي السلائف من عضلات الهيكل العظمي من الجذع والأطراف وشكل ، وموجودة في E8.5 9.5 - 4،5. Myogenin عامل التنظيمية اللازمة لتمايز الهيكل العظمي والعضلات 6-9. بيانات تثبت أن يترافق مع المروج myogenin الخاصة في E8.5 E9.5 والأجنة. لأن يعبر فقط myogenin في somites في هذه المرحلة من التنمية 6،10 ، وتشير البيانات إلى أن التفاعلات مع المروج myogenin الخاصة بها قد حدثت بالفعل في الهيكل العظمي خلايا العضلات في السلائف E8.5 الأجنة.
Protocol
1. عزل الأجنة
ملاحظة : يجب أن يتم تنفيذ جميع العمليات التي تنطوي على الفئران ، وفقا للرعاية الحيوان والسياسات المناسبة واستخدام البروتوكولات
- التحقق من وجود المكونات التزاوج في فئران الصباح بعد التزاوج وفصل الاناث عن الذكور تزاوج مسمار عن طريق وضعها في قفص مختلفة. يعتبر ظهرا من اليوم الذي يحتفل اليوم قابس التزاوج الجنينية 0.5 (E0.5) للتنمية.
- في E8.5 ، (أو مرحلة المرجوة ، إذا كان مختلفا) ، والتضحية الماوس باستخدام بروتوكول المعتمدة.
- الرطب بطن الحيوان الموت الرحيم مع الايثانول 70 ٪ وفتح التجويف البطني. وتعتبر هذه المواقع تشير إلى وجود زرع الأجنة النامية باعتبارها "حبات على سلسلة" الترتيب على طول كل قرن الرحم (الشكل 1A). باستخدام مقص ، وإزالة كل أبواق الرحم ، وقطع كل موقع على حدة لفصل الزرع (1B الشكل) ووضعها في طبق بتري 100 ملم تحتوي على درجة حرارة الغرفة (RT) تشريح المتوسطة (DMEM ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني ، و 20 درجة الحموضة 7.4 ملي HEPES ، 60 ميكروغرام / مل البنسلين ، 2 الستربتوميسين ملم).
- باستخدام الملقط ، وإزالة كل الجنين والأغشية المحيطة من أنسجة الرحم (الشكل 1C) ووضعها في وسط تشريح الطازجة.
- عزل الأجنة الفردية تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط. في هذه المرحلة من التنمية ، وتحيط بها الأجنة الجداري الكيس المحي ، التي تلامس الأنسجة deciduum ، والكيس المحي والحشوية وسلى. والسلى هو غشاء شفاف التي هي في تماس مباشر مع الجنين. يقع صفار الحشوي الكيس بين سلى وكيس المح الجداري ويتميز بسهولة في E8.5 - E9.5 أجنة من جراء وجود بارز للأوعية الدموية التي تغذي الجنين. إزالة كل جنين من الأغشية المحيطة به ونقل على حدة في لوحة جديدة تحتوي على وسائل الاعلام تشريح الدم لإزالة الزائدة. يمكن أن تختلف من مرحلة تنموية إلى جنين جنين وبين الفضلات ، وترد ممثل E8.5 أجنة وجنين E9.5 ممثل في الشكل 1D.
- نقل كل جنين إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على 200 إيبندورف ميكرولتر من وسائل الاعلام تشريح (الموضحة في الخطوة 4 أعلاه).
2. التجانس من الأجنة المعزولة
- إضافة 20 وحدة من النوع الثاني كولاجيناز في مجلد من 200 UL (المخفف في فوسفات 1X Dubbecco في التخزين المؤقت المالحة ؛ DPBS) لكل أنبوب إيبندورف.
- يهز بلطف العينات في شاكر 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
- Resuspend جيدا pipetting لعرقلة كتل من الخلايا.
- تطبيق نظام التعليق الخلية على الجزء العلوي من الخلايا العقيمة مصفاة (40 ميكرومتر حجم فتحات الشباك) وضعت أكثر من أنبوب 1.5 مل إيبندورف.
- تطبق على الفور 600 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 1X DPBS على رأس خلية مصفاة لاستكمال الانفصال. تجاهل مصفاة.
- الطرد المركزي العينات عند 4 في 4000 x ج لمدة 5 دقائق درجة مئوية.
- تجاهل طاف.
- Resuspend الكرية في 1 مل من DPBS 1X RT.
- الطرد المركزي للعينات في 4000 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.
- تجاهل طاف.
- Resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام تشريح RT.
- عدد الخلايا الجنينية. هناك ما معدله 3-5 × 10 6 cells/E8.5 الجنين.
3. عبر الارتباط الكروماتين
- إضافة 5.6 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37 ٪ إلى 200 عينات ميكرولتر لتركيز النهائي من الفورمالديهايد 1 ٪.
- احتضان العينات لمدة 10 دقيقة في RT.
- الطرد المركزي العينات في 4 درجات مئوية في 4000 x ج لمدة 3 دقائق.
- تجاهل طاف.
- Resuspend الخلايا مع DPBS 1X الباردة تحتوي على 80 ميكرولتر / مل كوكتيل مثبط البروتياز (PIC).
- الطرد المركزي العينات عند 4 في 4000 x ج لمدة 3 دقائق درجة مئوية.
- تجاهل طاف. في هذه الخطوة ، يمكن تجميد العينات في -80 درجة مئوية. المجمدة ، وعينات crosslinked مستقرة لعدة أشهر.
4. صوتنة
- Resuspend بيليه في الخلية في 100 ميكرولتر من تحلل RT العازلة SDS (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.1 درجة الحموضة) ، و 10 ملي EDTA وSDS 1 ٪ مع الموافقة المسبقة عن علم واضاف طازجة في 1 ميكرولتر حجم ميكرولتر PIC/800 المجموع). عندما معلق ، تضيف 100 من المجاهدين العازلة RT تحلل SDS لتعزيز إعادة تعليق. مزيج جيد من قبل pipetting وانعكاس.
- احتضان تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- يصوتن خلايا الحمض النووي لlysed القص إلى ما بين 200 و 500 basepairs باستخدام Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 دقائق × 8 مرات : الإعداد سعة 30 ثانية on/30 ثانية قبالة على السلطة (320 واط) عالية). وينبغي أن يكون محاطا العينات من قبل الطين الجليد. لا تسمح لتسخين العينات أعلاه درجة مئوية إلى 4 أو التجميد. هناك العديد من أنواع sonicators المتاحة. وينبغي أن يكون الأمثل لكل الظروف صوتنة sonicator إلى نتيجة في القص من الحمض النووي عبر مرتبطة بطول حوالي 500 سنة مضت.
- الطرد المركزي عينات sonicated عند 4 في XG 14000 لمدة 10 دقيقة درجة مئوية.
- Transfer وطاف في أنبوب إيبندورف الطازجة قبل تبريده على الجليد.
- تقسيم العينة sonicated في مدة أقصاها 5 aliquots. لقد عقدنا العزم تجريبيا ، والذي يمكن احد منقسم E8.5 الجنين إلى 5 aliquots. يمكن تحجيمها أحجام عينة أصغر أو أكبر تبعا لذلك. في هذه الخطوة ، يمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- قسامة احتياطي للاستخدام كمدخلات في وتخزين -20 درجة مئوية حتى الخطوة 6 متى سيتم عكس عبر الوصلات. تمييع aliquots الأخرى بمقدار 10 أضعاف في التخفيف العازلة CHIP (16.7 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.1) ، 1.2 ملي EDTA ، 1.1 ٪ تريتون X - 100 ، 167 ملي مول كلوريد الصوديوم وSDS 0.01 ٪) تحتوي على الموافقة المسبقة عن علم واضاف طازجة في 1 μl/800 ميكرولتر العازلة.
5. قبل المقاصة ومناعي
- قبل مسح طاف المخفف مع 75 ميكرولتر من سمك السلمون ، الحيوانات المنوية DNA / البروتين أو Agarose G - 50 ٪ في الطين 4 درجات مئوية ، مع التناوب ، لمدة 1 ساعة. اما استخدام البروتين وينبغي تحديد بروتين G او الخرز من الأجسام المضادة لاستخدامها في الرقاقة. على سبيل المثال ، أوصى البروتين الخرز الأرنب عن الأجسام المضادة ، في حين ينصح البروتين الخرز G للأجسام الماعز أو الماوس أضداد IgG 1. للحصول على معلومات أكثر تفصيلا ، انظر التوصيات المقدمة من قبل الشركة المصنعة حبة.
- الطرد المركزي عند درجة 4 في 2500 x ج لمدة 1 دقيقة.
- طاف لنقل جديد ، أنبوب إيبندورف قبل تبريده.
- إضافة الضد (4 ميكروغرام / العينة) للقسامة قبل تطهيرها واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع التناوب.
6. غسل مجمع الكروماتين البروتين حبة
- 60 إضافة ميكرولتر من الحيوانات المنوية سالمون DNA / البروتين أو الطين agarose G في كل قارورة واحتضان عند 4 درجة مئوية مع تناوب 1 ساعة. استخدام نفس نوع حبة تستخدم لتبادل المعلومات مسبقا في الخطوة 3 أعلاه.
- الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة.
- إزالة بعناية طاف وتجاهل. إبقاء الحمض النووي معقد البروتين حبة على الجليد.
- Resuspend بيليه ، ويغسل وفقا لتوجيهات أدناه مع مخازن يغسل 1 ، 2 ، 3 و 4. تغسل مخازن مبردة وينبغي 1-3 و 4 يجب أن يتم تنفيذ درجة مئوية ، ويغسل مع هذه المخازن في 4 درجات مئوية. غسل العازلة 4 ينبغي أن تكون في درجة حرارة الغرفة ويغسل مع هذا المخزن المؤقت يجب أن يكون تنفيذ في درجة حرارة الغرفة. يغسل كل هو لمدة 5 دقائق مع التناوب على درجة حرارة مناسبة. بعد كل أجهزة الطرد المركزي ، ويغسل في 4 درجات مئوية (درجة حرارة الغرفة لغسل العازلة يغسل 4) في 1000 x ج لمدة 1 دقيقة ، ثم نضح بعناية أو إزالة طاف.
العازلة 1 : قليلة العازلة يغسل الملح (20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.1 درجة الحموضة) ، 2 مم EDTA ، تريتون 1 ٪ X - 100 ،
150 مم كلوريد الصوديوم وSDS 0.1 ٪) ، 1 مل × 2 يغسل.
العازلة 2 : السامي العازلة يغسل الملح (20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.1 درجة الحموضة) ، 2 مم EDTA ، 1 ٪ تريتون X - 100 ،
500 ملم وكلوريد الصوديوم 0.1 ٪ SDS) ، 1 مل × 2 يغسل.
العازلة 3 : LiCl العازلة يغسل الملح (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.1 درجة الحموضة) ، 1 ملم EDTA ، 1 ٪ IGEPAL - CA630 ،
0.25 M LiCl و 1 ٪ حمض deoxycholic (ملح الصوديوم)) ، 1 مل × 1 يغسل.
العازلة 4 : TE العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (8.1 درجة الحموضة) ، 1 ملم EDTA) ، 1 مل × 2 يغسل.
7. شطف مجمع الأضداد الكروماتين
- Resuspend وغسلها الكروماتين البروتين حبة المعقدة في 250 ميكرولتر من شطف أعدت حديثا العازلة (1 ٪ SDS ، 0.1 M NaHCO 3). دوامة بقوة العينة لمدة 5 ثوان ، ثم في احتضان RT لمدة 15 دقيقة مع التناوب.
- الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 1 دقيقة على RT ونقل في أنبوب شطافة إيبندورف جديدة.
- كرر الخطوات 1 و 2 و الجمع بين eluates إيبندورف في أنبوب واحد. ينبغي أن تظل eluates في درجة حرارة الغرفة. عند الانتهاء من هذه الخطوة ، يمكن تخزين eluates -20 درجة مئوية في حين استخدامها مرة أخرى.
8. عكس الصليب الارتباط واستعادة الحمض النووي
- إضافة 20 ميكرولتر كلوريد الصوديوم 5 م لمدة 500 شطافة ميكرولتر (40 ميكروليتر / مل لمراقبة المدخلات).
- eluates حرارة بلغت 65 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 4 ساعة ليلة وضحاها.
- يمكن تشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة (بما في ذلك مراقبة المدخلات) على agarose هلام 2 ٪ بجانب علامات حجم الممتدة 0،1-1 KBP للتحقق من حجم قطعة من الحمض النووي. والحمض النووي تبدو وكأنها مسحة وليس الفرقة حادة. يمكن ترك بقية العينات في 65 درجة مئوية في حين أن جل قيد التشغيل.
- استعادة الحمض النووي من كل عينة باستخدام جل QIAquick استخراج كيت (Qiagen). إضافة 600 العازلة QG ميكرولتر (مرفق في المجموعة) لتحسين امتصاص الحمض النووي مع غشاء السيليكا في عمود الدوران QIAquick و 200 ميكرولتر الأيزوبروبانول في عينة ميكرولتر 500. علما بأن العازلة QG يحتوي على مؤشر الرقم الهيدروجيني مما يسمح بسهولة تحديد الرقم الهيدروجيني للعينة. إذا كان لون العينة يتحول من اللون الأصفر إلى اللون الأرجواني (الرقم الهيدروجيني> 7.5) بعد الاختلاط ، إضافة 10 ميكرولتر من NaAcetate م 3 (5.2 درجة الحموضة) إلى نموذج والمزيج. هذا يقلل من درجة حموضة الخليط لزيادة الحمض النووي ملزمة لحبات في العمود.
- قبل التحميل العمود ، والتحقق من خليط لتحديد ما إذا كان أي يعجل SDS موجودا. إذا حدث SDS هطول الأمطار ، ينبغي أن تكون درجة حرارة العينة في42 درجة مئوية حمام ماء حتى يعجل يختفي.
- تحميل 700 ميكرولتر من الخليط في العمود تدور QIAquick (العمود الأرجواني في المجموعة) ، والطرد المركزي في 14000 RT في XG عن 1 دقيقة. تجاهل من خلال تدفق من العمود قبل الشروع وكرر هذه الخطوة مع ما تبقى من العينة.
- إضافة 500 العازلة QG ميكرولتر لغسل العمود. RT في أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل من خلال تدفق من العمود قبل المتابعة.
- غسل العمود مع 700 ميكرولتر من PE غسل العازلة (المتوفرة في الطقم) التي تمت إضافة الإيثانول وفقا للتعليمات من قبل الشركة المصنعة. RT في أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل من خلال تدفق من العمود قبل المتابعة.
- كرر الخطوة الطرد المركزي لإزالة ما تبقى من المنطقة العازلة PE من العمود. تجاهل تدفق من خلال أنبوب والتحصيل.
- أزل الحمض النووي من العمود في أنبوب إيبندورف جديدة بإضافة 60 العازلة EB ميكرولتر (العازلة شطف الموردة في المجموعة).
- أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة في 14000 XG عن 1 دقيقة. ويمكن تخزين الحمض النووي في eluted -20 درجة مئوية حتى الكشف. A القراءات 260 من المواد المستردة تشير عادة تركيزات 90-120 نانوغرام / UL ، لاسترداد ما مجموعه 6-7 ميكروغرام في قسامة ~. بيد أن هناك نسبة 260/280 هذه العينات عادة> 1.8 ، مما يوحي بأن RNA موجودة في العينة. وبالتالي قد يكون المبلغ المحدد من الحمض النووي استردادها أقل.
9. تحليل الحمض النووي المستردة
- يمكن أن تتداخل مع SDS نشاط بوليميريز طق PCR. وينبغي إزالتها بالكامل قبل تنفيذ SDS PCR. احتضان الحمض النووي على الجليد لترسيب أي SDS المتبقية والطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 14000 XG عن 1 دقيقة. طاف لنقل خطوة جديدة tube.This إيبندورف ينصح بشدة.
- ويمكن الكشف عن الحمض النووي eluates التقليدية إما عن طريق PCR أو PCR الوقت الحقيقي الكمية (Q - PCR) مع الاشعال محددة لكل تسلسل ليتم تحليلها. ويمكن استخدام ميكرولتر 50-10 من مجموع شطافة الحمض النووي لأحد PCR أو رد فعل Q - PCR. لا يمكن أن يؤديها PCR مع مراقبة المدخلات مع تخفيف طية 50-10 من الحمض النووي ، مقارنة مع مبلغ من عينات أخرى. PCR والشروط Q - PCR سوف تختلف ، ولكن ، كمية محدودة من المواد بدءا يتطلب إضافية دورات PCR. PCR للكشف عن التقليدية ، فإننا نوصي بدءا من 40 دورة وتعديل حسب الحاجة.
10. ممثل النتائج
وقد استخدمنا هذا البروتوكول لأداء الرقاقة من كلا E8.5 والأجنة E9.5 (الشكل 2). وتظهر النتائج ان myogenin موجود على مروج myogenin في E8.5 E9.5 والأجنة. وقد تم تحليل الشذرة السلطات الوطنية المعينة يطهر PCR التقليدي (الشكل 2A) ، وPCR الوقت الحقيقي الكمي (الشكل 2B). في المقابل ، لم يكن هناك أي مؤشر على myogenin ملزما للمروج myogenin في الكيس المحي ، حيث لا يتم التعبير عن myogenin. والإنترفيرون - γ (IFNγ) كانت تستخدم المروج ، والذي يحتوي على تسلسلات المطابقة للموقع myogenin ملزمة ، كعنصر تحكم تسلسل سلبية. كما كان متوقعا ، لم تكن ملزمة myogenin إلى مروج IFNγ في أي من عينات الأنسجة التي تم اختبارها. E8.5 و 9.5 في الأجنة ، وأعرب عن myogenin تحديدا في somites (الشكل 3 ؛ 6،10) ، والتي هي السلائف لعضلات الهيكل العظمي. وبالتالي فإن النتائج تشير إلى أنه لا بد للداعية myogenin myogenin في somites في E8.5 وE9.5.
الشكل 1. E8.5 تشريح الجنين. (A) المعزولة قرن الرحم (اللوحة العلوية ؛ تضخم أعلى هو موضح في اللوحة السفلى). (ب) قطع الرحم قرن مع مقص لفصل المواقع التي تحتوي على زرع الأجنة الفردية الفردية. (ج) من أنسجة الأجنة جاحظ الرحم أثناء تشريح. سهام علامة الأجنة لا تزال مغطاة من خارج الجنينية الأنسجة. (د) عضوان E8.5 أجنة من القمامة نفسه. الجنين على اليسار لم تكن قد بدأت عملية تحول. الجنين على اليمين يمر تحول. اليمين المتطرف -- ممثل E9.5 الجنين.
الشكل 2. مقايسة الشذرة يتظاهرون myogenin ملزما للمروج في myogenin E8.5 E9.5 والأجنة. (الأعلى) تحليل PCR التقليدية من 5 المجاهدين من الحمض النووي المنقى من التجارب باستخدام الأجسام المضادة الشذرة myogenin أو غير محددة تم تنفيذ المشارع مع مفتش أن تضخيم جزء من المروج myogenin من -79 إلى +69 النسبية للموقع بدء النسخ التي يحتوي موقع myogenin الملزمة التي تقع في -12 الاشعال أو أن تضخيم جزء من المروج IFNγ التي تحتوي على تسلسل المطابقة للموقع myogenin ملزم يقع ~ 1075 غليان المنبع من موقع بدء النسخ. وكان تسلسل التمهيدي IFNγ المستخدمة 5' - GCT GAC TCA AGA CGA CCC GGC - 3 "و 5' - TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC - 3'. (القاع) التحليل الكمي PCR الوقت الحقيقي من نفس العينات المستخدمة في (A). ويتم رسم البيانات كنسبة مئوية من المدخلات + / -- الانحراف المعياري.
الشكل 3. يعبر Myogenin تحديدا في somites من E8.5 E9.5 والأجنة. جبل بأكمله في الموقع من التهجين myogenin محددة يظهر التعبير مرنا في somites. شريط الحجم في صورة E8.5 -- 200 ميكرون. شريط الحجم في صورة E9.5 -- 500 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الشذرة في البروتوكول وصفها ، نظهر أن يرتبط myogenin منظم عضلي مع المروج myogenin في الأنسجة العضلية الهيكلية موجودة في E8.5 السلائف واحد والأجنة E9.5. لقد تميزت الدراسات السابقة على نطاق واسع myogenin ملزمة لمربع البريد التي تحتوي على متواليات ، بدءا من التجارب الأولية في المختبر تحول هلام في المختبر باستخدام الكلمة أو البكتريا تنتج الحمض النووي myogenin وradiolabeled ترميز جزء من تسلسل الجينات ذات الصلة التنظيمية المستهدفة 11-20. وقد أثبتت الدراسات الشذرة التقليدية myogenin ملزما للمروج myogenin في نماذج زراعة الأنسجة لتكون العضل 21-24. ومع ذلك ، ليس هناك أدلة على أن يوضح أن myogenin بربط المروج myogenin الجنينية خلال تطوير الهيكل العظمي والعضلات ، على الرغم من يمكن للمرء أن يتوقع أن تكون هذه هي القضية في وقت لاحق في مرحلة التطور الجنيني على أساس التنظيم أسفل التعبير myogenin التي لوحظت في نسيج من اللسان E15.5 myogenin الفئران ناقص 25. وبالتالي البيانات تقدم دليلا على أن التفاعل بين myogenin والتفاعل المروج myogenin يحدث في الجسم الحي. طلب واضح من هذه التقنية لاستخدامها للتحقق من مدى ملاءمة الفسيولوجية للدراسات السابقة التي تميز النسيج محددة تنشيط الجين الأنسجة تنفيذها باستخدام نماذج الثقافة. ويمكن تطبيق أكثر إثارة للاهتمام هو أن استخدام هذه التقنية كجزء من التوصيف الأولي للعامل جديد أو uncharacterized سابقا لتحديد مدى ملاءمة الفسيولوجية للتفاعل معينة قبل إجراء الدراسات زراعة الأنسجة مصممة على بروتوكول تفاهم mechanisms.The الفنية أن تستخدم أيضا ل مقارنة مباشرة البروتين : التفاعلات التي تحدث في مراحل لونين تنموية محددة في نماذج الماوس يحتوي على التلاعب هندستها الوراثية.
ونحن نتوقع أن هذا الأسلوب سيكون مفيدا أيضا للدراسات دوام محددة من الأنسجة تنظيم الجينات خلال التنمية. من خلال تقييم العوامل المحددة : التفاعلات في المراحل الجنينية لونين مختلفة ، يمكن للمرء أن يحدد وجهة الوقت الذي تفاعل عوامل يمكن أن يحدث أولا ، تحديد ما إذا كان الحفاظ على التفاعل وخارجها طوال عملية تمايز أو كان أكثر عابرة في الطبيعة ، ويمكن تحديد أمر ملزم إذا عامل عوامل متعددة تتفاعل مع تسلسل معين. أخيرا ، ونحن نتصور أنه يمكن تمديد البروتوكول لإجراء لإعادة رقاقة 26 حيث تتعرض لونين تعافى من واحد إلى مناعي مناعي الثانية مع جسم مضاد ضد عاملا مختلفة يعتقد أنها شاركت في احتلال نفس قطعة من لونين. بروتوكول اعادة رقاقة يقدم دليلا قاطعا على أن أكثر من اثنين من العوامل المتميزة موجودة على قطعة نفسها من لونين ، وشرط المحتمل لهذا التعديل لن تكون هناك زيادة في كمية المواد البداية.
وكان تحقيق ملحوظا التي جاءت من جهودنا أن كمية محدودة من مادة البداية لم يكن عائقا أمام النجاح الذي يمكن للمرء أن يتنبأ ، وخصوصا ان البروتوكولات نسيج الخلايا ثقافة تستند غالبا ما توحي بدءا من السكان متجانسة الملايين أو عشرات الملايين من خلايا 26،27. نجاح جهودنا يتحدث لمتطلبات (وغالبا ما لا يمكن السيطرة عليها) الابتدائي عن الأجسام المضادة القادرة على مناعي محدد من عامل قيد التحقيق. حالما يتم التعرف على جسم قادر على مناعي ، يمكن للمحقق تحسين مقايسة Chip بواسطة المعايرة كمية من الأجسام المضادة المستخدمة. ومن المهم أن نلاحظ أن أكثر ليست دائما أفضل ، ونحن كثيرا ما يجد أن الكثير من الأجسام المضادة ، وبخاصة مع عينات من كمية محدودة ، وينتج عنه ارتفاع في الخلفية ملزمة لمتواليات لا صلة لها بالموضوع. بالإضافة إلى ذلك ، استخدام الكسور المناعي أو مصاهرة ، المنقى الأضداد غالبا ما تؤدي إلى انخفاض الخلفية مما يفعل استخدام الأمصال الضدية. ويمكن في كثير من الأحيان الخلفية من جسم أن يقاس من خلال مراقبة تشمل عينة تحتوي على حبات من دون أي الأجسام المضادة.
نستنتج أن استخدام الأجنة مرحلة مبكرة من أجل تحليل رقاقة من البروتين : لونين التفاعلات التي تحدث أثناء تنشيط جينات محددة الأنسجة لديها القدرة على تقديم رؤية كبيرة في الاستقراء وصيانة الأنسجة برامج محددة التعبير الجيني مباشرة ضمن سياق التنمية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة ماساتشوستس كلية الطب IACUC.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 GM56244 لاعلام ، والذي يتضمن منح الأموال من خلال الأميركي لإنعاش الاقتصاد وإعادة الاستثمار قانون عام 2009 ، والمعاهد الوطنية للصحة في R01 GM87130 JARP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
| Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, Suppl 1. 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
