Summary
Vi visar en kromatin immunoprecipitation (chip) för att identifiera faktorer interaktioner vid vävnads-specifika gener under eller efter debuten av vävnadsspecifika genuttryck i möss embryonal vävnad. Detta protokoll skall vara allmänt tillämpliga för studiet av vävnad-specifika genen aktivering som inträffar under normala fosterutvecklingen.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (chip) är ett kraftfullt verktyg för att identifiera proteiner: kromatin samspel som sker i samband med levande celler 1-3. Denna teknik har i stor utsträckning utnyttjats i celler vävnadskultur, och i mindre utsträckning, i obearbetad vävnad. Tillämpningen av chip till gnagare embryonal vävnad, särskilt i äldre tid av utveckling, kompliceras av den begränsade mängden vävnader och heterogena celler och typer vävnad i embryot. Här presenterar vi en metod för att utföra ChIP med en dissocierade embryonala dag 8,5 (E8.5) embryo. Klippt kromatin från en enda E8.5 embryo kan delas in i upp till fem alikvoter, vilket gör att utredaren tillräckligt material för kontroller och för utredning av specifika proteiner: kromatin interaktioner.
Vi har använt denna teknik för att börja dokumentera protein: kromatin interaktioner under specifikationen av vävnad-specifika program genuttryck. Den heterogenitet celltyper i ett embryo begränsar nödvändigtvis tillämpningen av denna teknik eftersom resultatet är identifieringen av proteiner: kromatin interaktioner utan att urskilja om interaktioner förekommer i alla, en delmängd av, eller en enda celltyp (s). Det är dock undersökning av vävnad-specifika gener under eller efter uppkomsten av vävnad-specifika genuttryck möjligt av två skäl. Först isolerar immunoprecipitation av vävnad specifika faktorer nödvändigtvis kromatin från cellen typ där faktorn uttrycks. För det andra bör immunoprecipitation av coactivators och histoner som innehåller post-translationella modifieringar som är förknippade med genaktivering bara finns på gener och reglerande sekvenser i den celltyp där genen är eller har aktiverats. Tekniken bör tillämpas på studiet av de flesta vävnads-specifika händelser genen aktivering.
I exemplet som beskrivs nedan används vi E8.5 och E9.5 embryon musen för att undersöka faktor bindande på en skelettmuskel specifika genen. Somites, som är en föregångare vävnader från vilken skelettet musklerna i bålen och lemmar kommer att utgöra, är närvarande vid E8.5-9,5 4,5. Myogenin är en reglerande faktor som krävs för skelettmuskulaturen differentiering 6-9. Uppgifterna visar att myogenin är förknippade med den egna medel i E8.5 och E9.5 embryon. Eftersom myogenin enbart uttrycks i somites i detta skede av utvecklingen 6,10, den data indikerar att myogenin interaktioner med sin egen promotor redan har inträffat i skelettmuskulaturen muskelceller föregångare i E8.5 embryon.
Protocol
1. Isolering av embryon
Notera: Alla transaktioner som omfattar möss bör utföras i enlighet med lämpliga djurvård och politik användning och protokoll
- Kontrollera om det finns en parning plugg i den kvinnliga musen på morgonen efter parning och separera parade honor från stuteriet män genom att placera dem i en annan bur. Noon av dagen att parningen kontakten följs anses embryonala dag 0,5 (E0.5) av utveckling.
- På E8.5, (eller den önskade scenen, om annan), offra musen med hjälp av ett godkänt protokoll.
- Blöt buk euthanized djur med 70% etanol och öppna bukhålan. Den implantationsställen tyder på förekomst av att utveckla embryon ses som en "pärlor på ett snöre" arrangemang längs varje livmoder horn (Figur 1A). Använda sax, ta bort båda livmoder horn, skär varje implanteringsstället sig för att separera (Figur 1B) och placera dem i en 100 mm petriskål innehåller rumstemperatur (RT) dissektion medium (DMEM, 10% fetalt bovint serum, 20 mm HEPES pH 7,4 , 60 mikrogram / ml penicillin, 2 mm streptomycin).
- Använd pincett, ta bort varje embryo och omgivande membran från livmoder vävnad (Figur 1C) och placera dem i färskt dissektion medium.
- Isolera enstaka embryon under ett dissekera mikroskop med hjälp av pincett. I detta skede i utvecklingen, är de embryon som omges av parietalceller gulesäcken, vilka kontakter de deciduum vävnad, visceral gulesäcken och amnion. Amnion är en genomskinlig membran som är i direkt kontakt med embryot. De viscerala gulesäcken ligger mellan amnion och parietalceller gulesäcken och är lätt att skilja på E8.5-E9.5 embryon genom närvaro av framstående blodkärl som vårdar embryot. Ta bort varje embryo från sitt omgivande membran och överföra individuellt i en ny skylt som innehåller dissekering media för att avlägsna överskott av blod. Utvecklingsstadiet kan variera från embryo till embryo och mellan kullar, representant E8.5 embryon och en representant E9.5 embryo visas i Figur 1D.
- Överför varje embryo till ett 1,5 ml Eppendorf-rör som innehåller 200 ìl dissektion media (som beskrivs i steg 4 ovan).
2. Homogenisering av de isolerade Embryo
- Lägg till 20 enheter kollagenas typ II i en volym av 200 UL (utspädd i 1X Dubbecco är Fosfatbuffrad saltlösning, DPBS) till varje Eppendorf-rör.
- Skaka försiktigt prover i ett 37 ° C shaker vid 100 rpm i 20 min.
- Resuspendera väl genom att pipettera att störa klumpar av celler.
- Applicera cellsuspension på toppen av steril cell sil (40 ìm maskstorlek) placeras över ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Omedelbart tillämpa 600 ìl rumstemperatur 1X DPBS ovanpå cellen sil för att slutföra separationen. Kasta silen.
- Centrifugera proverna vid 4 ° C vid 4000 xg under 5 minuter.
- Kassera supernatanten.
- Suspendera pelleten i 1 ml RT 1X DPBS.
- Centrifugera proverna vid 4000 xg under 1 minut vid RT.
- Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 200 l av RT dissektion medier.
- Räkna embryonala celler. Det är ett genomsnitt 3-5 x 10 6 cells/E8.5 embryo.
3. Cross-link Chromatin
- Tillsätt 5,6 l 37% formaldehyd till 200 l prover för en slutlig koncentration av 1% formaldehyd.
- Inkubera prov i 10 min vid RT.
- Centrifugera proverna vid 4 ° C vid 4000 xg i 3 min.
- Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna med kallt 1X DPBS som innehåller 80 ml / ml proteashämmare cocktail (PIC).
- Centrifugera proverna vid 4 ° C vid 4000 xg i 3 min.
- Kassera supernatanten. I detta steg kan proverna frysas ned till -80 ° C. Den frysta, tvärbundet prover är hållbara i flera månader.
4. Sonication
- Resuspendera cellpelleten i 100 l av RT SDS lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl (pH 8,1), 10 mM EDTA och 1% SDS med nyligen lagt PIC vid 1 l PIC/800 l totala volymen). När återsuspenderade, lägga till ytterligare 100 ul av RT SDS lyseringsbuffert att främja resuspension. Blanda väl genom att pipettera och inversion.
- Inkubera cellsuspension på is i 10 min.
- Sonikera lyseras cellerna att klippa DNA till mellan 200 och 500 baspar med en Diagenode Bioruptor ™ UCD200 (5 min x 8 gånger: amplitud inställning av 30 sek on/30 sek iväg på höga (320 watt) effekt). Proverna ska vara omgiven av en is flytgödsel. Låt inte proverna till varma över 4 ° C eller att frysa. Det finns många typer av sonicators tillgängliga. Sonication villkor bör optimeras för varje sonicator leda till klippning av tvärbunden DNA till en längd av ca 500 bp.
- Centrifugera sonicated prover vid 4 ° C vid 14 tusen xgi 10 min.
- Tverför supernatanten till ett nytt Eppendorf-rör nedkylda på is.
- Dela sonicated provet i högst fem alikvoter. Vi har empiriskt fastställt att ett E8.5 embryo kan delas in i fem alikvoter. Större eller mindre urvalsstorlekar kan skalas därefter. I detta steg kan provet förvaras vid -80 ° C tills vidare användning.
- Reserv en alikvot för att användas som underlag och förvara vid -20 ° C fram till steg 6 när tvärbindningar kommer att återföras. Späd andra portioner 10-faldig i chip spädningsbuffert (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1,1% Triton X-100, 167 mM NaCl och 0,01% SDS) som innehåller färska läggas PIC vid 1 μl/800 l buffert.
5. Pre-clearing och Immunoprecipitation
- Pre-klara den utspädda supernatanten med 75 ìl av lax-spermiens DNA / Protein A eller G agaros-50% uppslamning vid 4 ° C, med rotation, för 1 timme. Användning av antingen Protein A eller protein pärlor G skall fastställas av antikroppar som ska användas för chipet. Till exempel är protein A pärlor rekommenderas för kanin antikroppar, medan protein G pärlor rekommenderas för get-antikroppar eller mus-IgG 1-antikroppar. För mer detaljerad information, se rekommendationer från pärla tillverkaren.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 2500 xg i 1 min.
- Överför supernatanten till ett nytt, nedkylda Eppendorf-rör.
- Lägg antikropp (4 mikrogram / prov) till före rensas alikvot och inkubera över natten vid 4 ° C med rotation.
6. Tvätt kromatinet-protein-pärla Complex
- Tillsätt 60 ìl Lax spermiens DNA / Protein A eller G agaros slam i varje rör och inkubera vid 4 ° C med rotation för 1 tim. Använd samma sträng typ som används för pre-clearing i steg 3 ovan.
- Centrifugera vid 4 ° C vid 1000 xg i 1 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten och kassera. Håll DNA-protein-pärla komplex på is.
- Resuspendera och tvätta pelleten enligt anvisningarna nedan med tvätt buffert 1, 2, 3 och 4. Tvätta buffertar 1-3 bör kylas till 4 ° C och tvättar med dessa buffertar bör utföras vid 4 ° C. Tvättbuffert 4 bör vid rumstemperatur och tvättar med denna buffert bör utföras vid rumstemperatur. Varje tvätt i 5 minuter med rotation vid lämplig temperatur. Efter varje tvätt, centrifugera vid 4 ° C (rumstemperatur tvättbuffert 4 tvättar) vid 1000 xgi 1 min, sedan försiktigt aspirera till eller ta bort supernatanten.
Buffert 1: Låg salt tvättbuffert (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
150 mM NaCl och 0,1% SDS), 1 ml x 2 tvättar.
Buffer 2: Hög salt tvättbuffert (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl och 0,1% SDS), 1 ml x 2 tvättar.
Buffert 3: LiCl salt tvättbuffert (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630,
0,25 M LiCl och 1% desoxicholsyra syra (natriumsalt)), 1 ml x 1 tvätt.
Buffert 4: TE buffert (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 tvättar.
7. Eluering av Chromatin-antikroppskomplex
- Resuspendera tvättade kromatin-protein-pärla komplex i 250 ìl av nyberedd eluering buffert (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Kraftigt virvel provet för 5 sek, sedan inkubera vid RT i 15 min med rotation.
- Centrifugera vid 2500 xgi 1 min vid RT och överföra eluatet i en ny Eppendorf-rör.
- Upprepa steg 1 och 2 och kombinera eluat i samma Eppendorf-rör. Den eluat bör förvaras i rumstemperatur. Efter avslutad detta steg kan eluat förvaras vid -20 ° C fram till användning.
8. Omvänd Cross-länk och Recover DNA
- Tillsätt 20 l 5 M NaCl för 500 l eluat (40 ml / ml för kontroll av registrering).
- Värm eluat vid 65 ° C i ett vattenbad i 4 timmar till över natten.
- 10 ìl av varje prov (inklusive kontroll av registrering) kan köras på en 2% agarosgel bredvid storlek markörer som spänner från 0,1 till 1 KBP att kontrollera storleken DNA-fragment. DNA-visas som en smädelse, och inte ett skarpt band. Resten av proverna kan lämnas vid 65 ° C medan gelen är igång.
- Återvinn DNA från varje prov med hjälp av en QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Tillsätt 600 l QG buffert (medföljer i satsen) för att optimera DNA adsorption med kiseldioxid membranet i en QIAquick spin kolumn och 200 l isopropanol till en 500 l prov. Observera att QG buffert innehåller en pH-indikator ger enkel bestämning av pH i provet. Om färgen av provet varv från gult till lila (pH> 7,5) efter blandningen, tillsätt 10 ìl av 3 M NaAcetate (pH 5,2) till provet och blanda. Detta minskar pH-värdet i blandningen för att maximera DNA-bindning till pärlorna i kolumnen.
- Före lastning kolumnen, kontrollera blandningen att avgöra om något SDS fällning är närvarande. Om SDS nederbörden har inträffat, ska provet värmas i en42 ° C vattenbad tills fällningen försvinner.
- Belastning 700 ìl av blandningen i QIAquick spinn kolumn (lila kolumn i satsen) och centrifugera vid RT på 14 tusen xg i 1 min. Kasta flödet genom ur kolonnen innan du fortsätter och upprepar detta steg med resten av provet.
- Tillsätt 500 l QG buffert att tvätta kolonnen. Centrifugera vid RT på 14 tusen xg i 2 min. Kasta flödet genom från kolumnen innan du fortsätter.
- Tvätta kolonnen med 700 l av PE tvättbuffert (medföljer i satsen) som etanol har tillsatts enligt instruktioner från tillverkaren. Centrifugera vid RT på 14 tusen xg i 1 min. Kasta flödet genom från kolumnen innan du fortsätter.
- Upprepa centrifugeringen steg för att helt ta bort resten av PE-buffert från kolonnen. Kasta flödet genom och provröret.
- Eluera DNA från kolumn till en ny Eppendorf-rör genom att tillsätta 60 l EB buffert (eluering buffert som medföljer i satsen).
- Centrifugera vid rumstemperatur på 14 tusen xg i 1 min. Den eluerat DNA kan förvaras vid -20 ° C till dess upptäckt. En 260 avläsningar av det återvunna materialet visar vanligtvis koncentrationer av 90-120 ng / ul, för en total återhämtning av ~ 6-7 ug per delmängd. Dock är en 260/280 förhållandet mellan dessa prover typiskt> 1,8, vilket tyder på att RNA i provet. Således det exakta beloppet av återvunnet DNA kan vara lägre.
9. Analys av Återvunna DNA
- SDS kan störa aktiviteten hos PCR-Taq-polymeras. SDS bör tas bort helt innan du utför PCR. Inkubera DNA på is för att fälla någon kvarvarande SDS och centrifugera vid 4 ° C vid 14 tusen xg i 1 min. Överför supernatanten till ett nytt Eppendorf tube.This steg rekommenderas starkt.
- De DNA eluat kan upptäckas antingen genom konventionell PCR eller kvantitativ realtids-PCR (Q-PCR) med primers specifika för varje sekvens som skall analyseras. 50-10 l från total DNA eluatet kan användas för en PCR-eller Q-PCR-reaktionen. PCR med kontroll av registrering kan utföras med en 5-10 gånger utspädning av DNA jämfört med det belopp av andra prover. PCR och Q-PCR-förhållanden varierar dock kräver begränsad mängd utgångsmaterial extra PCR-cykler. För konventionell PCR-detektion, rekommenderar vi börjar med 40 cykler och justera efter behov.
10. Representativa resultat
Vi har använt detta protokoll för att utföra chip från både E8.5 och E9.5 embryon (figur 2). Resultaten visar att myogenin förekommer på myogenin promotor i E8.5 och E9.5 embryon. ChIP renat DNA analyserades med konventionell PCR (Figur 2A) och kvantitativ realtids-PCR (Figur 2B). Däremot fanns det ingen indikation på myogenin binder till myogenin promotor i gulesäcken, där myogenin inte uttrycks. Det interferon-γ (IFNγ) promotor, som innehåller sekvenser som matchar myogenin bindningsstället, användes som ett negativt sekvensstyrning. Som väntat var myogenin inte bunden till IFNγ promotor i någon av de testade vävnadsprover. I E8.5 och 9,5 embryon är myogenin specifikt uttryck i somites (Figur 3, 6,10), som är föregångare till skelettmuskulaturen. Således tyder resultaten på att myogenin är bundet till myogenin promotor i somites på E8.5 och E9.5.
Figur 1. E8.5 embryo dissekering. (A) Isolerade livmodern horn (övre panelen, högre förstoringen visas i nedre panelen). (B) Uterine horn klippa med sax till separata enskilda implantationsställen innehåller enskilda embryon. (C) Embryon sticker ut från livmoder vävnad under dissektion. Pilar markerar embryon fortfarande omfattas av extra embryonal vävnad. (D) Två E8.5 embryon från samma kull. Embryot till vänster har inte börjat processen med att vända. Embryot till höger genomgår svarvning. Längst till höger - representativa E9.5 embryo.
Figur 2. ChIP analysen visar myogenin binder till myogenin promotor i E8.5 och E9.5 embryon. (Top) konventionell PCR-analys av 5 ul av DNA renat från Chip experiment med en myogenin antikroppar eller icke-specifik IgG utfördes med primers som förstärker en del av myogenin promotorn från -79 till 69 i förhållande till start platsen för transkription som innehåller en myogenin bindningsställe ligger på -12 eller primer som förstärker en del av IFNγ promotor som innehåller en sekvens som matchar myogenin bindningsstället ligger ~ 1075 bp uppströms transkriptionen startar sajten. Den IFNγ Primer sekvenser var 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 'och 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3 ". (Längst ned) Kvantitativa realtids-PCR analys av samma prov som används i (A). Denuppgifter ritas i% av ingång + / - standardavvikelse.
Figur 3. Myogenin är specifikt uttryck i somites av E8.5 och E9.5 embryon. Hela montera in situ hybridisering av myogenin visar specifika mRNA uttryck i somites. Storlek bar i E8.5 bild - 200 ìm. Storlek bar i E9.5 bild - 500 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den beskrivna ChIP protokollet visar vi att myogenic regulatorn myogenin förknippas med myogenin promotorn i skelettmuskel föregångare vävnad som finns i samma E8.5 och E9.5 embryon. Innan studier har i stor utsträckning präglats myogenin bindning till E låda som innehåller sekvenser, med början den inledande in vitro-gel skift försök att använda in vitro översättas eller bacterially produceras myogenin och radioaktivt märkt DNA som kodar för relevanta delar av regelverket mål gensekvenser 11-20. Konventionella ChIP studier har visat myogenin binder till myogenin promotor i modeller vävnadsodling för myogenesis 21-24. Det finns dock inga bevis som visar att myogenin binder till myogenin promotor under embryonal skelettmuskulaturen utveckling, även om man kan förutse att detta är fallet senare i embryogenesen bygger på en nedreglering av myogenin uttryck observerades i E15.5 tungan vävnad från myogenin bristfällig möss 25. Således de data visar att samspelet mellan myogenin och myogenin initiativtagaren interaktionen sker in vivo. En uppenbar tillämpning av denna teknik är att använda den för att kontrollera fysiologiska betydelsen av tidigare studier som kännetecknar vävnadsspecifika genaktivering vävnad utförs med hjälp av kultur-modeller. Ju mer intressant tillämpning är att använda denna teknik som en del av första karakterisering av en ny eller tidigare uncharacterized faktor för att bestämma den fysiologiska relevansen av en specifik interaktionsstudie innan du utför studier vävnadsodling utformade på att förstå funktionella mechanisms.The protokoll kan också användas för att direkt jämföra protein: kromatin interaktioner inträffar vid specifika utvecklingsstadier i musmodeller som innehåller en konstruerad genetisk manipulation.
Vi räknar med att denna metod kommer också att vara användbar för studier gången under vävnadsspecifika genreglering under utveckling. Genom att bedöma specifik faktor: kromatin interaktioner vid olika embryonala stadier, kan man identifiera den tidpunkten då den faktor samspelet först inträffar, kan avgöra om samspelet bibehölls inom och bortom differentiering processen eller var mer övergående natur, och kunde bestämma För faktor bindande om flera faktorer samverkar med en specifik sekvens. Slutligen, föreställer vi oss att protokollet kan utvidgas till en ny ChIP förfarande 26 där kromatin återhämtat sig från en immunoprecipitation utsätts för en andra immunoprecipitation med en antikropp mot en annan faktor tros vara tillsammans upptar samma bit av kromatin. Den förnyade ChIP protokollet ger mer avgörande bevis för att två olika faktorer är närvarande på samma bitar av kromatin, den troliga krav på denna ändring skulle vara en ökning av mängden utgångsmaterial.
En märklig insikt som kom från våra ansträngningar var att den begränsade mängden utgångsmaterial var inte hinder för framgång som man kunde ha förutspått, speciellt med tanke på att vävnadsodling cellbaserade protokoll ofta föreslår att man börjar med en homogen befolkning på miljontals eller tiotals miljoner celler 26,27. Framgången för vårt arbete talar för att den primära (och ofta okontrollerbara) krav för antikroppar som kan specifika immunoprecipitation av faktorn under utredning. När en antikropp har identifierats som kan immunoprecipitation kan utredaren optimera ChIP analysen genom upptitrering av mängden antikroppar som används. Det är viktigt att notera att mer är inte alltid bättre, vi ofta tycker att för mycket antikroppar, speciellt med prover av begränsad mängd, resulterar i högre bakgrunden bindning till irrelevanta sekvenser. Dessutom användning av immunoglobulinfraktioner eller affinitetsrenade antikroppar ofta resultera i lägre bakgrund än använder av antiserum. Bakgrund från kontrollen antikroppar kan ofta mätas genom att ta ett prov som innehåller pärlor utan någon antikropp.
Vi drar slutsatsen att med hjälp tidigt stadium embryon för ChIP analys av proteiner: kromatin samspel som sker under aktivering av vävnad-specifika gener har potential att ge betydande insikt i induktion och underhåll av vävnad-specifika program genuttryck direkt inom ramen för utvecklingssamarbetet .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som respektive University of Massachusetts Medical School IACUC.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH R01 GM56244 till Ani, som inkluderar medel beviljas via amerikanska Återvinning och Reinvestment Act från 2009, och genom NIH R01 GM87130 till JARP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
| Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, Suppl 1. 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
