Un metodo semplice e affidabile sulle isolamento e la coltura di cellule staminali neurali da scartati tessuto fetale umano corticale è descritto. Culture derivati da noti disturbi neurologici umano può essere utilizzato per la caratterizzazione di processi patologici cellulari e molecolari, oltre a fornire una piattaforma per valutare l'efficacia farmacologica.
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Articolo metodologico
Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) risiedono lungo il neuroepitelio zona ventricolare durante lo sviluppo della placca corticale. Questi primi progenitori in ultima analisi, dare origine a cellule progenitrici intermedi e più tardi, i diversi sottotipi di cellule neuronali e gliali che formano la corteccia cerebrale. La capacità di generare e ampliare NSCs umano (la cosiddetta neurosfere) da scartati tessuto normale fetale fornisce un mezzo con cui studiare direttamente gli aspetti funzionali di sviluppo umano normale NSC 1-5. Questo approccio può anche essere diretto verso la generazione di NSCs da disturbi neurologici conosciuti, offrendo così l'opportunità di identificare i processi di malattia che altera la proliferazione progenitrici, la migrazione e la differenziazione 6-9. Ci siamo concentrati sull'identificazione dei meccanismi patologici umani NSCs sindrome di Down che possa contribuire al fenotipo malattia accelerata di Alzheimer 10,11. Né in vivo e in vitro modelli murini in grado di replicare il repertorio identiche di geni localizzati sul cromosoma umano 21.
Qui usiamo un metodo semplice e affidabile per isolare da sindrome di Down NSCs abortiti corteccia fetale umano e farle crescere in coltura. La metodologia prevede aspetti specifici di raccolta del, dissezione dei tessuti con reperi anatomici limitata, separazione delle cellule, placcatura e passaging di NSC umano. Forniamo anche alcuni protocolli di base per indurre la differenziazione di NSC umano in sottotipi di cellule più selettivi.
Protocollo
1. Preparazione di soluzioni e materiali per la dissezione e la conservazione della cultura di cellule staminali neurali
- Preparare 100 ml di media dissezione (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) in anticipo e conservare in frigorifero.
- Prepare100 ml di terreno di coltura (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) e tenere a 37 ° C a bagnomaria.
- Preparare il congelamento delle cellule-media (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% DMSO) a lungo termine crioconservazione delle cellule.
- Se lo si desidera, preparare il 4% paraformaldeide (PFA) per il fissaggio del tessuto.
- Sterili, pinze e lame bisturi in autoclave con maniglie vengono utilizzati....
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Discussione
Ci sono vari approcci verso la cultura del tessuto fresco e la produzione di linee cellulari umane. Storicamente, tessuto fresco è stato raccolto e colto immediatamente di generare vari tipi di cellule del sistema nervoso centrale. Questo approccio però è chiaramente limitata dal numero di campioni che possono essere ottenuti, che nel caso di campioni umani, di solito è abbastanza piccolo. Dato il grado minimo di manipolazione, le cellule neuronali in coltura fresco fornire il sistema più affidabile sperimentale, limita.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health: HD054347 e NS063997-01 per VLS. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Fondo sulle cellule staminali attraverso l'Empire State di New York State Department del Contratto Sanità # C024324 di VLS. Le opinioni qui espresse sono esclusivamente quelle dell'autore e non riflette necessariamente il parere del Consiglio di cellule staminali Empire State Building, il New York State Department of Health, o lo Stato di New York. VLS è un Doris Duke Clinical Scientist Award Recipient sviluppo. Ringraziamo anche il professor Timothy Vartanian per il dono di Anti-O1, Anti-O4 anticorpi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociazione media |
| Staminali Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Terreno di coltura |
| Siero bovino fetale | Invitrogen | 10091-148 | Medio congelati |
| Hanks soluzione (-Ca 2 +, Mg-2 +) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociazione media |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Medio congelati |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociazione media |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127 | Fissazione soluzione |
| bFGF | R & S | 234-FSE | Differenziazione media |
| SHH | R & S | 1845-SH | Differenziazione media |
| PDGF-AA | R & S | 221-AA | Differenziazione media |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differenziazione media |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Coniglio anti-DCX | Segnalazione cellulare | 4604s | 1:200 |
| Coniglio anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Coniglio anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Coniglio anti-O1 | doni del professor Timothy Vartanian * | 01:50 | |
| Coniglio anti-O4 | Regali del professor Timothy Vartanian * | 01:50 | |
| 40μm cellule filtro | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Dipartimento di Neurologia e Neuroscienze, Weill Cornell Medical College, New York, USA
Riferimenti
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and ....
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Ristampe e permessi
