Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale
Summary
Un metodo semplice e affidabile sulle isolamento e la coltura di cellule staminali neurali da scartati tessuto fetale umano corticale è descritto. Culture derivati da noti disturbi neurologici umano può essere utilizzato per la caratterizzazione di processi patologici cellulari e molecolari, oltre a fornire una piattaforma per valutare l'efficacia farmacologica.
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) risiedono lungo il neuroepitelio zona ventricolare durante lo sviluppo della placca corticale. Questi primi progenitori in ultima analisi, dare origine a cellule progenitrici intermedi e più tardi, i diversi sottotipi di cellule neuronali e gliali che formano la corteccia cerebrale. La capacità di generare e ampliare NSCs umano (la cosiddetta neurosfere) da scartati tessuto normale fetale fornisce un mezzo con cui studiare direttamente gli aspetti funzionali di sviluppo umano normale NSC 1-5. Questo approccio può anche essere diretto verso la generazione di NSCs da disturbi neurologici conosciuti, offrendo così l'opportunità di identificare i processi di malattia che altera la proliferazione progenitrici, la migrazione e la differenziazione 6-9. Ci siamo concentrati sull'identificazione dei meccanismi patologici umani NSCs sindrome di Down che possa contribuire al fenotipo malattia accelerata di Alzheimer 10,11. Né in vivo e in vitro modelli murini in grado di replicare il repertorio identiche di geni localizzati sul cromosoma umano 21.
Qui usiamo un metodo semplice e affidabile per isolare da sindrome di Down NSCs abortiti corteccia fetale umano e farle crescere in coltura. La metodologia prevede aspetti specifici di raccolta del, dissezione dei tessuti con reperi anatomici limitata, separazione delle cellule, placcatura e passaging di NSC umano. Forniamo anche alcuni protocolli di base per indurre la differenziazione di NSC umano in sottotipi di cellule più selettivi.
Protocol
Discussion
Ci sono vari approcci verso la cultura del tessuto fresco e la produzione di linee cellulari umane. Storicamente, tessuto fresco è stato raccolto e colto immediatamente di generare vari tipi di cellule del sistema nervoso centrale. Questo approccio però è chiaramente limitata dal numero di campioni che possono essere ottenuti, che nel caso di campioni umani, di solito è abbastanza piccolo. Dato il grado minimo di manipolazione, le cellule neuronali in coltura fresco fornire il sistema più affidabile sperimentale, l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health: HD054347 e NS063997-01 per VLS. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Fondo sulle cellule staminali attraverso l'Empire State di New York State Department del Contratto Sanità # C024324 di VLS. Le opinioni qui espresse sono esclusivamente quelle dell'autore e non riflette necessariamente il parere del Consiglio di cellule staminali Empire State Building, il New York State Department of Health, o lo Stato di New York. VLS è un Doris Duke Clinical Scientist Award Recipient sviluppo. Ringraziamo anche il professor Timothy Vartanian per il dono di Anti-O1, Anti-O4 anticorpi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA
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