Summary
Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.
Abstract
Neurale Stammzellen (NSCs) entlang der ventrikulären Zone Neuroepithel wohnen während der Entwicklung der kortikalen Platte. Diese frühen Vorfahren die zu weiteren Zwischen-Vorläuferzellen und später die verschiedenen neuronalen und glialen Zell-Subtypen, dass die Großhirnrinde bilden. Die Fähigkeit, zu generieren und zu erweitern menschlichen NSCs (sog. Neurosphären) aus gebrauchten normalen fetalen Gewebe bietet ein Mittel, mit denen direkt zu untersuchen, um die funktionalen Aspekte der normalen menschlichen NSC Entwicklung 1-5. Dieser Ansatz kann auch auf die Generation der NSCs aus bekannten neurologischen Erkrankungen gerichtet sein, wodurch sich die Möglichkeit, Krankheitsprozesse, die Vorläuferzellen Proliferation, Migration und Differenzierung 6-9 verändern zu identifizieren. Wir haben auf die Identifizierung pathologischer Mechanismen im menschlichen Down-Syndrom NSCs, die zur beschleunigten Alzheimer-Phänotyp 10,11 beitragen könnten konzentriert. Weder in vivo noch in vitro-Maus-Modelle replizieren kann die gleiche Repertoire von Genen auf dem menschlichen Chromosom 21 befindet.
Hier verwenden wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung Down-Syndrom NSCs aus abgetriebenen menschlichen Föten Kortex und wachsen sie in der Kultur. Die Methodik bietet spezifische Aspekte der Ernte der Gewebe, Dissektion mit begrenzten anatomischen Landmarken, Zellsortierung, Beschichtungs-und Passagieren des menschlichen NSCs. Wir bieten auch einige grundlegende Protokolle zur Induktion Differenzierung von humanen NSCs in selektiver Zell-Subtypen.
Protocol
1. Herstellung von Lösungen und Materialien für die Präparation und Pflege von neuralen Stammzellen Kultur
- Bereiten 100ml Dissektion Medium (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) vor der Zeit und in den Kühlschrank.
- Prepare100 ml Kulturmedium (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) und halten bei 37 ° C in einem Wasserbad.
- Bereiten Zell-Einfriermedium (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% DMSO) für die langfristige Kryokonservierung von Zellen.
- Wenn gewünscht, bereiten 4% Paraformaldehyd (PFA) für Gewebefixierung.
- Sterile, autoklaviert Pinzette und Skalpell Klingen mit Griffe sind für die Präparation verwendet.
- Beiseite einer Pipette Pistole, 10 ml Transferpipetten und 40 uM Zellsieb (BD Falcon 352340) für Dissoziation.
- Beiseite mehrere 10 cm Kulturschalen (BD) für die Präparation, 50 ml Zentrifugenröhrchen (BD) für die Dissoziation, 1,5 ml Röhrchen für die Gewebe-Lagerung und gefrorene Röhrchen (BD) für das Einfrieren von Zellen.
2. Isolierung humaner neuraler Stammzellen aus dem menschlichen fetalen Gehirns
- Die Ernte der lebensfähiges Gewebe sofort nach Beendigung des Fötus ist entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. Für elektive Prozeduren können Timing, um Proben zu erhalten im Voraus gebucht werden, um so Zeit nach fetalen Tod zu minimieren. Die Produkte der Empfängnis sind innerhalb von 2 Stunden nach dem Eingriff geerntet, sondern im Idealfall auf elektiven Eingriffen innerhalb weniger Minuten erreicht werden. Die fetalen Gewebe oft fragmentiert sind. Im allgemeinen sind jedoch ein wesentlicher Teil des Gehirns bleibt für visuelle Identifizierung. Einschränkungen von Gestationsalter (GA) werden von gesetzlichen Vorschriften bestimmt, sondern wurden unter Verwendung dieses Protokolls zwischen 18-22 Wochen GA.
- Fetal Gehirn ist in einer 10 ml Petrischale mit eiskaltem KNOCKOUT DMEM/F12 Lösung gegeben. Identifizieren verschiedenen Teilen des Kortex von anatomischen Landmarken. Grenzen für die Frontal-und parieto-occipital Kortex richtet sich nach den hochgerechneten Schnittpunkt der zentralen Sulcus und Sylvi-Fissur. Dissect Gewebe aus dem frontalen Kortex anterior des Sulcus centralis und entlang der Grenze von der Sylvi-Fissur mit chirurgische Messer, achten Sie darauf, halten den Ventrikel intakt und unbeschädigt sein.
- Entfernen Sie alle verbleibenden Blut und Meningen aus dem abgetrennten Block von frontalen Kortex. Wenn die Probe von ausreichender Qualität, ist es ideal, um den Block in mehrere kleinere Proben für verschiedene Zwecke zu sezieren: Sektionen (in 4% Paraformaldehyd, PFA) und Protein / mRNA-Assays (schnell in -80 ° C gefroren).
- Übertragen Sie die ausgewählten Gehirn blockieren, um ein 50 ml Zentrifugenröhrchen, und fügen Sie eiskalten KNOCKOUT DMEM/F12 Lösung bei etwa 3-mal des Gewebes der Lautstärke. Vorsichtig distanzieren das Gewebe durch mechanische Pipettieren mit einer 10 ml Vollpipette, bis alle Gewebe fragmentiert wird (in der Regel 20-30 mal) und dann filtern Sie die Zellen durch eine 40 uM Zellsieb (BD Falcon 352340) um Einzel-oder in der Nähe einzelnen Zelle zu erhalten Suspension.
- Centrifuge die Zellsuspension bei 2000 rpm und Raumtemperatur für 5 min, Zellpellet in 10 ml frisches, warmes Kulturmedium (Stem Pro NSC SFM), und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zählkammer.
- 5 ml warmem Kulturmedium in je 25 cm 2 Kulturflaschen und Transfer 2x10 6 Zellen in jeden Kolben. Kulturen sind in einem 37 ° C / 5% CO 2-Inkubator für 1 Woche vor der Analyse. Ändern Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche für weitere Kulturen oder Experimente.
3. Manipulaton neuraler Stammzellen für die weitere Charakterisierung oder Experimente
- Neurosphären in der Regel in 1 bis 2 Wochen bilden unter den empfohlenen Kulturbedingungen mit NSC Durchmesser im Bereich zwischen 200 und 400 um. Neurosphären in diesem Stadium kann mit 0,2 g / L EDTA in Calcium-und Magnesium freie Hanks Medium (Hanks) bei 37 ° C dissoziiert für 15 min auf einzelne Zellen zu erhalten. Cells Suspension bei 2000 rpm, in frischen Hanks gespült gesponnen, und replattiert in warmen Nährboden für Subkultur.
- Zur Einleitung Differenzierung werden dissoziierten Zellen auf poly-D-lysine/laminin 1 beschichtete Deckgläser in einer Dichte von 1x10 5 Zellen pro Deckglas (24mmX24mm) ausplattiert. Oligodendrozyten-Differenzierung wird durch die Aufrechterhaltung der Zellen in KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD) +2% B27 (50X, Invitrogen, Main, MD) +10 ng / ml bFGF 100 ng / ml SHH + 10ng/ml PDGF-AA für erreicht 2 Tage, dann Umstellung auf das gleiche Medium ohne Wachstumsfaktoren für weitere 5 Tage. Neuronale Differenzierung wird durch das Aufrechterhalten Zellen in KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50x) für 7 Tage erreicht. Astrocyte Differenzierung wird durch Kultivieren von Zellen in KNOCKOUT DMEM/F12 +1% FBS für eine Woche getan.
- Die Transfektion von neuronalen Stammzellen mit Gene können mit dissoziierten Zellen aus dem vorgeformten Neurosphären durchgeführt werden. Hier haben wir gezeigt, dass die Stammzellen mit EGFP-C1 durch Elektroporation transfiziert. Die Elektroporation von EGFP-C1-Konstrukt wurde unter Verwendung von amaxa Nucleofector Kits für Mouse Neural Stem Cells (VPG-1004) mit amaxa Nucleofector Device (Lonza AAD-1001), nachdem das Unternehmen die Anweisung. Kurz gesagt, wurden 5 ug DNA mit 1 x 10 6 Zellen mit 100 ul Transfektion Medium gemischt und nach Puls Elektroporation wurden die Zellen in der neuralen Stammzellen erhalten Medium für weitere Kultur resuspendiert. Die Differenzierung der transfizierten Zellen wurden mit der Dissoziation von Neurosphären 3-4 Tage nach der Elektroporation verarbeitet, nach dem gleichen Verfahren in Schritt 3.2 beschrieben.
4. Freezing neuralen Stammzellen und Subkulturen
- Dissoziiert Zellsuspensionen werden zentrifugiert und in Einfriermedium mit einer Konzentration von 1x10 7 Zellen / Flasche / ml. Langsam frieren die Zellen in -20 ° C, -80 ° C dann in flüssigen Stickstoff Transfer für lange Lagerung.
- Die Zellen werden schnell mit 37 ° C aufgetaut Wasserbad gewaschen und in erwärmt DMEM/F12 +10% Serum für eine Wäsche, zentrifugiert, um das Einfrieren Medium zu entfernen, und erneut in die erwärmte Kulturmedium.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Neurale Stammzellen von einem normalen Fötus mit 18 Wochen Schwangerschaftsdauer wurden nach dem beschriebenen Verfahren und Neurosphären nach einer Woche mit runden, glatten Rändern und ziemlich homogen Größe (Abb. 2a) zu sehen ist, kultiviert. Diese Neurosphären mit EGFP-C1 oder anderen Konstrukten transfiziert und anschließend unter Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb.2b,). Gegründet Neurosphären wurden dann dissoziiert mit EDTA und verchromt als dispergierte Zellen auf beschichteten Deckgläsern. Zellen, die unter den jeweiligen Protokollen unterschieden wurden mit 4% parafamaldehyde fixiert und gefärbt mit verschiedenen Zelltyp spezifischen Markern. Multipotentiality ist mit der Expression von Markern bezeichnend für Neuronen (Fig2C, D, Rhodamin) Astrozyten (Fig2E, F, Rhodamin) und Oligodendrozyten (Fig2G, H, Rhodamin) beobachtet. Die Zellen nicht erworben Elektroporation von EGFP wurden auch in verschiedenen Zelltypen differenzieren und gefärbt mit verschiedenen Zell-spezifische Marker. Multipotentiality ist mit der Expression von Markern bezeichnend für Neuronen (Fig3A, B, Fluorescein) Astrozyten (Fig3C, Rhodamin und Fig3D, Fluorescein) und Oligodendrozyten (Fig3E, F, Rhodamin) beobachtet.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Verfahren zur neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen Gehirns zu isolieren
Abbildung 2. Undifferenzierte und differenzierte menschliche Nervenzellen in vitro propagiert. (A) Neurosphären unter Phasenkontrast-Mikroskopie gezeigt demonstrieren glatte, runde Grenzen und schnelles Wachstum nach der Kultur seit über 1 Woche. (B) Einführung der verschiedenen Plasmide und Konstrukte können durch Transfektion erreicht werden. Drei Tage nach der EGFP-C1-Transfektion, zeigen mehrere Zellen die Expression des grün fluoreszierenden Proteins, wie unter Fluorescein Immunfärbung und Fluoreszenzmikroskopie zu sehen. EGFP-C1 transfizierten Neurosphären werden dissoziiert und differenziert unter verschiedenen Bedingungen zu Neuronen (C, D), Astrozyten (E, F) und Oligodendrozyten (G, H) und sehen unter Rhodaminfluoreszenz. Gleichzeitig sind transfizierten EGFP-positiven Zellen unter Fluorescein-Fluoreszenz gezeigt. Transfizierten Zellen (weiße Pfeilspitzen) sind zu unterscheiden von nicht transfizierten Zellen (weiße Pfeile). Die Zellkerne sind mit Hoechst33342 gefärbt. Scale-Bars sind 200 pm für A, 100 pm für B und 25 um für CH.
Abbildung 3. Neurosphären ohne Transfektion sind dissoziiert und differenziert unter verschiedenen Bedingungen in Neuronen (A, B, Fluorescein), Astrozyten (C, Rhodamin, D, Fluorescein) und Oligodendrozyten (E, F, Rhodamin). Die Zellkerne sind mit Hoechst33342 gefärbt. Scale-Bars sind 25 mu m für AF.
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Discussion
Es gibt verschiedene Ansätze zur Kultur frischem Gewebe und Herstellung von menschlichen Zelllinien. Historisch gesehen hat frischem Gewebe geerntet und sofort in verschiedenen Zelltypen im zentralen Nervensystem zu erzeugen kultiviert. Dieser Ansatz ist jedoch klar durch die Anzahl der Proben, die erhalten-die im Falle der menschlichen Proben, ist in der Regel recht klein werden kann, begrenzt. Angesichts der minimalen Grad an Manipulation, bieten frisch gezüchteten Nervenzellen den zuverlässigsten experimentelles System, indem potentielle Artefakte aus längeren Kultivierung. Das begrenzte Angebot führte zu einem zweiten Ansatz zur Erzeugung menschlichen Zelllinien, die durch das Einsetzen verschiedener Onkogene 12, 13 war verewigt. Die Sorge für diesen Ansatz lag in der Möglichkeit, dass onkogene Manipulation dieser Zellen würde die Eigenschaften von Zellen zu verändern. Zusätzlich wurde ein Teil der Begründung für die Erzeugung von menschlichen Zelllinien das Potenzial für die Transplantation und Behandlung verschiedener menschlicher Erkrankungen. Immortalisierten Zelllinien könnten, um das Risiko von Krebs Wachstum begünstigen. Der Vorteil dieser Zelllinien ist die Einheitlichkeit der Linien, ihre Fähigkeit, die verschiedenen neuronalen und glialen Phänotypen, das in einer Region des Gehirns zu erlassen, und die Leichtigkeit der Erzeugung Vielzahl von Kulturen. Zur Überwindung der möglichen onkogenen Einschränkungen wurden verschiedene Ansätze zur Kultivierung von primären humanen neuralen Stammzellen verwendet worden. Die meisten Methoden basieren auf EGF und bFGF Manipulation von Zellen basiert, mit Haft-oder Suspensionskultur Techniken. Diese unterschiedlichen Ansätze führen zu unterschiedlichen Reinheiten von NSC 14. Svendsen et al. berichteten über eine Methode der NSC Kultur Abschnitt gebildet Neurosphären mit der Zell-Zell-Kontakte gepflegt (15), die eine reiche Produktion von NSC in kurzer Zeit geben kann. Allerdings kann Oligodendrozyten nicht mit diesen Neurosphären in späteren Passagen erreicht werden. Anreicherung Neurosphären mit EGF und bFGF können auch die Transkriptions-und zellulären Phänotypen in vitro 14. Verwenden der frühen Passage Kulturen bietet einen vernünftigen Kompromiss zwischen dem Bedürfnis nach einer großen Anzahl von Kulturen und die geringste Sorge für die Einführung der Kultur Artefakt. In jüngster Zeit haben Fortschritte in der Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch erzwungene Ausdruck einer Teilmenge von Genen benötigt, um Stammzell-Eigenschaften beibehalten worden. IPS-Zellen haben den Vorteil, dass große Mengen von menschlichen Zellen als auch das Potenzial, alle verschiedenen Arten von Zellen, die den menschlichen Körper bestehen zu generieren. Aktuell wird dieser letzte Vorteil macht auch dieses Modell System weniger attraktiv, dass die Signalisierung Mechanismen, um Zellen zu einem bestimmten Zelltyp (dh Vorderhirn Neuronen) zu verwandeln, sind nicht bekannt.
Die gängigen Methoden zur Erzeugung von menschlichen NSCs beschrieben bieten einige geringfügige Abweichungen aus anderen veröffentlichten Ansätze. Die meisten bisherigen Methoden verwenden verschiedene enzymatische oder chemische Mittel zur Zelle Dissoziation (Trypsin oder Papain) auf die NSC von fetalen Kortex distanzieren. In der Regel angesichts der großen Menge an Gewebe, verwenden wir sanfte mechanische Verreibung mit feinen Zelle Filtration, lebensfähige einzelne Zellen, die nur minimale Manipulation unterzogen wurden erhalten. Darüber hinaus minimiert dieser Ansatz die Zeit aus dem Gewebe der Ernte bis Gewebekulturen / storage, die kritisch für die menschliche Proben ist.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die menschliche neurale Stammzellen aus gebrauchten frontale kortikale Gewebe 7,9,10,11 isolieren. Die Methodik zur Isolierung der Neurosphären variiert leicht zwischen Mensch und Maus, mit dem hier beschriebenen Ansatz für den Erhalt von Einzel-Zellsuspensionen in menschlichen Gewebeproben optimiert. Es gibt mehrere Überlegungen in die Verwendung von menschlichem Gewebe. In erster Linie ist die Begrenzung der Zeit nach fetalen Tod vor dem Beginn der Zelle Dissoziation und Ernte. Dieses Problem kann durch vorherige Planung von Abtreibungen und die Aufrechterhaltung Proben bei 4 ° C begrenzt werden Zweitens ist es wichtig zu versuchen, Landmarken für die Dissoziation der kortikalen Gewebe zu identifizieren. Zu diesem Zweck ist es sinnvoll, zur Information der Arzt, der die gescheiterte Verfahren, um Gehirn Integrität zu wahren, wenn möglich. Drittens ist es wichtig zu erkennen, dass die Skala des menschlichen fetalen Gehirns sogar bei 18-22 Wochen bei weitem übersteigt, dass selbst ein Erwachsener Maus oder Ratte und daher die Notwendigkeit, die Dissoziation, Filtration und Waschen mit einem größeren Durchsatz System ausführen (dh größere Plastmetall, 10 ml Kunststoff-Pipetten vs Glas poliert Pipetten, mehrere Proben parallel bearbeitet). Viertens werden die Zellen mechanisch dissoziiert und es ist nicht notwendig, um sicherzustellen, dass alle Gewebestücke sind weg. Vielmehr ist es vorzuziehen, Verreibung so viel wie möglich zu minimieren, mit dem Verständnis, dass die Filtration wird das unerwünschte größere Gewebestücke und separate genug einzelne NSCs aus der größeren Stichprobe für die Kultivierung zu entfernen. Viertens sind die Reagenzien gewählt für den menschlichen Neurosphären optimiert. Schließlich one sollte nicht versuchen, einzelne Zellen zu stören, nachdem sie vergoldet sind, um so die Aggregation zu minimieren.
Sobald die menschliche neurale Stammzellen klonale Kugeln gebildet haben, können sie in einzelne Zellen trennen, wie oben beschrieben, und passagiert, um festzustellen, Selbst-Erneuerung Fähigkeiten oder differenziert in die verschiedenen Zelltypen mit unterschiedlichen Kombinationen von Wachstumsfaktoren und / oder Proteinen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
HD054347 und NS063997-01 bis VLS: Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil auch durch den Empire State Stem Cell Fonds durch die New York State Department of Health Contract # C024324 zu VLS unterstützt. Die darin geäusserten Meinungen sind hier ausschließlich die des Autors und spiegeln nicht unbedingt die des Empire State Stem Cell Board, das New York State Department of Health, oder des Staates New York. VLS ist ein Doris Duke Clinical Scientist Developmental Preisträgerin. Wir danken auch Professor Timothy Vartanian für seine Gabe der Anti-O1, Anti-O4-Antikörper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D Systems | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D Systems | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D Systems | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell Signaling Technology | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | Dako | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | Dako | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| * Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA | |||
References
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