Generering av neuronala stamceller från kasserade mänskliga foster Bark-Tissue
Summary
En enkel och tillförlitlig metod för isolering och odling av neurala stamceller från kasserade mänskliga foster kortikal vävnad beskrivs. Kulturer från kända mänskliga neurologiska sjukdomar kan användas för karakterisering av patologiska cellulära och molekylära processer, samt ge en plattform för att bedöma farmakologiska effekt.
Abstract
Neurala stamceller (NSCs) bor längs den ventrikulära zonen neuroepithelium under utvecklingen av den kortikala plattan. Dessa tidiga stamceller ger slutligen upphov till mellanliggande progenitorer och senare, de olika neuronala och gliacellsmarkörer subtyper som utgör hjärnbarken. Förmågan att skapa och utveckla mänskliga NSCs (sk neurospheres) från kasserade normala fostervävnad ger ett medel att direkt studera de funktionella aspekterna av människans normala NSC utveckling 1-5. Detta angreppssätt kan också riktas mot generering av NSCs från kända neurologiska sjukdomar, vilket ger möjlighet att identifiera sjukdomen processer som förändrar stamfader spridning, migration och differentiering 6-9. Vi har fokuserat på att identifiera patologiska mekanismer i människans Downs syndrom NSCs som kan bidra till den accelererade Alzheimers sjukdom fenotyp 10,11. In vivo eller in vitro-musmodeller kan reproducera samma repertoar av gener finns på människans kromosom 21.
Här använder vi en enkel och tillförlitlig metod för att isolera Downs syndrom NSCs från aborterade mänskliga foster cortex och odla dem i kultur. Den metod som ger specifika aspekter av skörd vävnaden, dissektion med begränsad anatomiska landmärken, cell sortering, plätering och passaging mänskliga NSCs. Vi ger också några grundläggande protokoll för att inducera differentiering av mänskliga NSCs till mer selektiva cell subtyper.
Protocol
Discussion
Det finns olika metoder mot kultur frisk vävnad och producera mänskliga cellinjer. Historiskt sett har färsk vävnad skördats och odlade omedelbart att generera olika typer av celler i centrala nervsystemet. Detta tillvägagångssätt är dock klart begränsad av det antal prover som kan erhållas-som i fallet för prover från människa, är oftast ganska liten. Med tanke på den minimala graden av manipulation, färska odlade neurala celler ger den mest tillförlitliga experimentella system genom att begränsa pot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health: HD054347 och NS063997-01 till VLS. Detta arbete stöddes också delvis av Empire State Stem Cell fonden genom New York State Department of Health Kontrakt # C024324 till VLS. De åsikter som uttrycks här är enbart de av författaren och återspeglar inte nödvändigtvis de från Empire State Stem Cell styrelsen, New York State Department of Health, eller staten New York. VLS är en Doris Duke Clinical Scientist Developmental Award mottagare. Vi vill också tacka professor Timothy Vartanian för hans gåva av Anti-O1, Anti-O4 antikroppar.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Dissociation medium |
| Stem Pro NSC SFM | Invitrogen | A10509-01 | Culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10091-148 | Frozen medium |
| Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) | Invitrogen | 14175-095 | Dissociation medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Frozen medium |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 431788 | Dissociation medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Fixation solution |
| bFGF | R&D | 234-FSE | Differentiation medium |
| SHH | R&D | 1845-SH | Differentiation medium |
| PDGF-AA | R&D | 221-AA | Differentiation medium |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Differentiation medium |
| Mouse Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Rabbit Anti-DCX | Cell signaling | 4604s | 1:200 |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Rabbit Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Rabbit Anti-O1 | gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| Rabbit Anti-O4 | Gifts of Professor Timothy Vartanian* | 1:50 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 |
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA
References
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
- Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O’Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
- Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
- Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
- Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
- Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
- Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down’s syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
- Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
- Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
- Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r., Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
- Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
- Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities?. Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
- Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).
