Summary

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Published: May 25, 2011
doi:

Summary

Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.

Abstract

Neurale Stammzellen (NSCs) entlang der ventrikulären Zone Neuroepithel wohnen während der Entwicklung der kortikalen Platte. Diese frühen Vorfahren die zu weiteren Zwischen-Vorläuferzellen und später die verschiedenen neuronalen und glialen Zell-Subtypen, dass die Großhirnrinde bilden. Die Fähigkeit, zu generieren und zu erweitern menschlichen NSCs (sog. Neurosphären) aus gebrauchten normalen fetalen Gewebe bietet ein Mittel, mit denen direkt zu untersuchen, um die funktionalen Aspekte der normalen menschlichen NSC Entwicklung 1-5. Dieser Ansatz kann auch auf die Generation der NSCs aus bekannten neurologischen Erkrankungen gerichtet sein, wodurch sich die Möglichkeit, Krankheitsprozesse, die Vorläuferzellen Proliferation, Migration und Differenzierung 6-9 verändern zu identifizieren. Wir haben auf die Identifizierung pathologischer Mechanismen im menschlichen Down-Syndrom NSCs, die zur beschleunigten Alzheimer-Phänotyp 10,11 beitragen könnten konzentriert. Weder in vivo noch in vitro-Maus-Modelle replizieren kann die gleiche Repertoire von Genen auf dem menschlichen Chromosom 21 befindet.

Hier verwenden wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung Down-Syndrom NSCs aus abgetriebenen menschlichen Föten Kortex und wachsen sie in der Kultur. Die Methodik bietet spezifische Aspekte der Ernte der Gewebe, Dissektion mit begrenzten anatomischen Landmarken, Zellsortierung, Beschichtungs-und Passagieren des menschlichen NSCs. Wir bieten auch einige grundlegende Protokolle zur Induktion Differenzierung von humanen NSCs in selektiver Zell-Subtypen.

Protocol

1. Herstellung von Lösungen und Materialien für die Präparation und Pflege von neuralen Stammzellen Kultur Bereiten 100ml Dissektion Medium (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) vor der Zeit und in den Kühlschrank. Prepare100 ml Kulturmedium (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) und halten bei 37 ° C in einem Wasserbad. Bereiten Zell-Einfriermedium (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% DMSO) für die langfristige Kryokonservierung von Zellen. Wenn gewünscht, bereiten 4% Paraformaldehyd (PFA) …

Discussion

Es gibt verschiedene Ansätze zur Kultur frischem Gewebe und Herstellung von menschlichen Zelllinien. Historisch gesehen hat frischem Gewebe geerntet und sofort in verschiedenen Zelltypen im zentralen Nervensystem zu erzeugen kultiviert. Dieser Ansatz ist jedoch klar durch die Anzahl der Proben, die erhalten-die im Falle der menschlichen Proben, ist in der Regel recht klein werden kann, begrenzt. Angesichts der minimalen Grad an Manipulation, bieten frisch gezüchteten Nervenzellen den zuverlässigsten experimentelles S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

HD054347 und NS063997-01 bis VLS: Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil auch durch den Empire State Stem Cell Fonds durch die New York State Department of Health Contract # C024324 zu VLS unterstützt. Die darin geäusserten Meinungen sind hier ausschließlich die des Autors und spiegeln nicht unbedingt die des Empire State Stem Cell Board, das New York State Department of Health, oder des Staates New York. VLS ist ein Doris Duke Clinical Scientist Developmental Preisträgerin. Wir danken auch Professor Timothy Vartanian für seine Gabe der Anti-O1, Anti-O4-Antikörper.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
KNOCKOUT DMEM/F12 Invitrogen 12660-012 Dissociation medium
Stem Pro NSC SFM Invitrogen A10509-01 Culture medium
Fetal Bovine Serum Invitrogen 10091-148 Frozen medium
Hanks solution (-Ca2+, -Mg2+) Invitrogen 14175-095 Dissociation medium
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Frozen medium
EDTA Sigma-Aldrich 431788 Dissociation medium
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Fixation solution
bFGF R&D 234-FSE Differentiation medium
SHH R&D 1845-SH Differentiation medium
PDGF-AA R&D 221-AA Differentiation medium
B27 Invitrogen 17504-044 Differentiation medium
Mouse Anti-MAP2 Sigma-Aldrich M2320 1:200
Rabbit Anti-DCX Cell signaling 4604s 1:200
Rabbit Anti-GFAP DAKO Z0334 1:200
Rabbit Anti-S100B DAKO Z0311 1:200
Rabbit Anti-O1 gifts of Professor Timothy Vartanian*   1:50
Rabbit Anti-O4 Gifts of Professor Timothy Vartanian*   1:50
40μm cell strainer BD Falcon 352340  

* Timothy Vartanian, MD, PhD, Department of Neurology and Neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA

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Cite This Article
Lu, J., Delli-Bovi, L. C., Hecht, J., Folkerth, R., Sheen, V. L. Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue. J. Vis. Exp. (51), e2681, doi:10.3791/2681 (2011).

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